HẠT THẠCH TIÊU CHUẨN: CƠ SỞ, CHUẨN BỊ VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2025

Các thạch đã chuẩn là một tổ chức phi - có chọn lọc, môi trường nuôi cấy rắn được thiết kế để định lượng được khối lượng vi khuẩn trong các mẫu hiếu khí nước uống, nước thải, nước uống sữa, và các loại thực phẩm khác. Môi trường này còn được gọi là thạch PCA, từ viết tắt của nó trong tiếng Anh Plate Count Agar. Nó được tạo ra vào năm 1953 bởi Buchbinder, Baris và Goldstein.

Môi trường thạch đếm chuẩn bao gồm dịch chiết nấm men, triptein, glucose, thạch và nước cất. Công thức này chứa các nguyên tố dinh dưỡng cơ bản cho phép phát triển lượng vi sinh vật hiếu khí hiện nay, không đòi hỏi khắt khe.

Các dung dịch pha loãng thập phân để đếm CFU trong số lượng thạch tiêu chuẩn. Nguồn: Quentin Geissmann

Vì môi trường không chứa chất ức chế, vi khuẩn có thể phát triển mà không có bất kỳ hạn chế nào, điều này lý tưởng cho việc đếm khuẩn lạc nói chung. Tuy nhiên, kỹ thuật định lượng mảng bám sẽ không phát hiện được tất cả vi khuẩn có mặt, mà chỉ phát hiện được những vi khuẩn có khả năng phát triển trong điều kiện môi trường mà thạch đếm tiêu chuẩn đã được gieo hạt.

Theo nghĩa này, kỹ thuật định lượng đĩa thường nhằm xác định số lượng vi khuẩn thuộc loại ưa khí hiếu khí, tức là những vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ từ 25 đến 40 ° C, với nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 ° C. .

Nhóm vi khuẩn này rất quan trọng, vì hầu hết các vi khuẩn gây bệnh cho con người đều được tìm thấy ở đó.

Cần lưu ý rằng đôi khi có thể thú vị khi định lượng lượng vi khuẩn psychrophilic có trong thực phẩm. Những vi khuẩn này phát triển ở nhiệt độ thấp (<20 ° C) và là nguyên nhân khiến thực phẩm phân hủy nhanh hơn, ngay cả khi để trong tủ lạnh.

Tương tự như vậy, vi khuẩn ưa nhiệt, phát triển trong phạm vi từ 50 ° C đến 80 ° C trở lên, có thể quan trọng trong một số loại thực phẩm như thực phẩm đóng hộp.

Định lượng vi sinh vật được biểu thị bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trên gam hoặc mililit mẫu.

Nền tảng

Môi trường đếm tiêu chuẩn được thiết kế để cho phép sự phát triển thành công của vi khuẩn hiếu khí không khó tính vì dịch chiết nấm men, triptein và glucose cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển tốt của vi sinh vật.

Mặt khác, môi trường có màu sáng và bề ngoài trong suốt, đó là lý do tại sao nó là lý tưởng cho việc hình dung các khuẩn lạc được phát triển bằng phương pháp gieo hạt sâu (đổ trong đĩa).

Cũng có thể đếm khuẩn lạc bằng phương pháp gieo hạt trên bề mặt Drigalski spatula.

Khi tải lượng vi sinh vật cao, phải thực hiện pha loãng thập phân của mẫu nghiên cứu để có thể đếm CFU.

Cần lưu ý rằng phương tiện này được khuyến nghị bởi Hiệp hội Y tế Công cộng Hoa Kỳ (APHA) để đếm những người mê hiếu khí.

Sự chuẩn bị

Cân 23,5 g môi trường đã khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Để hòa tan hoàn toàn, nên đun nóng hỗn hợp bằng cách khuấy thường xuyên cho đến khi sôi. Các bước phụ tiếp theo phụ thuộc vào kỹ thuật gieo hạt được sử dụng.

Đối với kỹ thuật đĩa đổ

Phân phối bằng cách cho từ 12 đến 15 ml vào các ống nghiệm. Sau đó, khử trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút. Cho phép đông đặc theo chiều dọc ở dạng khối. Bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng.

Làm chảy phích cắm khi bạn định sử dụng nó. Sau khi nấu chảy, giữ nó trong nồi cách thủy ở 44-47 ° C trong khi chuẩn bị mẫu.

Để gieo hạt trên bề mặt

Khử trùng môi trường trong nồi hấp ở 121 ° C và sau đó phân phối 20 ml vào đĩa Petri vô trùng. Để đông đặc, đảo đều và cất vào tủ lạnh cho đến khi dùng.

Các tấm nhiệt độ trước khi sử dụng. Độ pH của môi trường phải là 7,0 ± 0,2.

Sử dụng

Agar đếm chuẩn được sử dụng trong kỹ thuật đếm ưa khí hiếu khí trong quá trình phân tích vi sinh vật nước và thực phẩm. Việc đếm các vi khuẩn ưa khí là cần thiết, vì nó quyết định chất lượng vệ sinh của mẫu đang nghiên cứu.

Việc áp dụng kỹ thuật này (sử dụng môi trường này) cho phép hình dung vĩ mô của các khuẩn lạc cô lập để định lượng chúng.

Kỹ thuật đổ tấm (gieo hạt theo chiều sâu)

-Quá trình

Kỹ thuật này bao gồm những điều sau:

1) Đồng nhất mẫu để phân bố lại các vi khuẩn có mặt.

2) Hỗn dịch ban đầu được tạo trong chai hoặc túi vô trùng, theo tỷ lệ 10 gr hoặc 10 ml mẫu trong 90 ml chất pha loãng (10 ^-1 ).

3) Từ huyền phù ban đầu, các dung dịch pha loãng thập phân thích hợp được tạo ra tùy thuộc vào loại mẫu. Ví dụ: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Các dung dịch pha loãng được thực hiện bằng nước peptone hoặc đệm phosphat.

Để thực hiện việc này, lấy 1 ml huyền phù ban đầu và cho vào 9 ml dịch pha loãng, tiếp tục pha loãng nếu cần, bây giờ lấy 1 ml dung dịch pha loãng 10 ^-2 , v.v.

4) Lấy 1 ml của mỗi dung dịch pha loãng và cho vào các đĩa Petri vô trùng rỗng.

5) Thêm vào mỗi đĩa 12 đến 15 ml thạch đếm chuẩn đã được đun chảy trước đó và để lắng ở 44 - 47 ° C.

6) Xoay nhẹ các đĩa để phân bố đều mẫu dọc theo thạch và để nó đông lại.

7) Đảo ngược các đĩa và ủ ở 37 ° C trong môi trường hiếu khí trong 24 đến 48 giờ.

8) Vào cuối thời gian, các đĩa được kiểm tra và đếm các khuẩn lạc trong độ pha loãng cho phép. Những tấm có từ 30 đến 300 CFU được chọn để đếm.

Việc đếm có thể được thực hiện thủ công hoặc bạn có thể sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc.

Các giá trị cho phép trên mỗi ml mẫu có thể khác nhau giữa các quốc gia tùy thuộc vào các quy định mà chúng được quản lý.

-Tính toán của UFC

Tính toán chung được thực hiện theo công thức sau:

Công thức tính tổng quát định lượng CFU. Nguồn: Cục Quản lý Thuốc, Thực phẩm và Công nghệ Y tế Quốc gia (ANMAT). Phân tích vi sinh thực phẩm, phương pháp phân tích chính thức, vi sinh vật chỉ thị. 2014 Tập 3. Có tại: anmat.gov.ar

Biểu thị kết quả bằng 1 hoặc 2 chữ số, nhân với cơ số 10 thích hợp. Ví dụ: nếu kết quả là 16,545, nó được làm tròn dựa trên chữ số thứ ba thành 17,000 và nó sẽ được biểu thị như sau: 1,7 x 10 ⁴ . Bây giờ, nếu kết quả là 16,436, hãy làm tròn thành 16,000 và biểu thị 1,6 x 10 ⁴ .

Kỹ thuật gieo hạt bề mặt

-Quá trình

- Nhỏ 0,1 ml mẫu trực tiếp nếu là chất lỏng, huyền phù ban đầu 10 ^-1 hoặc của các độ pha loãng liên tiếp 10 ^-2 , 10 ^-3 , v.v., vào giữa đĩa thạch đếm chuẩn.

-Phân bố đều mẫu bằng thìa Drigalski hoặc đũa thủy tinh hình chữ L. Để yên trong 10 phút.

- Lật ngược các đĩa và ủ hiếu khí ở 37 ° C trong 24 đến 48 giờ.

-Tiến hành đếm khuẩn lạc, chọn những đĩa nằm trong khoảng 20 - 250 CFU.

-Tính toán của UFC

Để tính toán, hệ số pha loãng được áp dụng, hệ số này là nghịch đảo. Số được làm tròn thành 2 chữ số có nghĩa (làm tròn theo chữ số thứ ba) và được biểu thị theo lũy thừa của cơ số 10. Ví dụ: nếu 224 CFU được đếm trong mẫu không pha loãng (10 ^-1 ), thì báo cáo là 22 x 10 ¹ CFU , nhưng nếu con số là 225, 23 x 10 ¹ CFU được báo cáo.

Bây giờ, nếu 199 CFU được tính trong độ pha loãng 10 ^-3 , 20 x 10 ⁴ CFU sẽ được báo cáo, nhưng nếu 153 CFU được tính trong cùng độ pha loãng, 15 x 10 ⁴ CFU sẽ được báo cáo.

QA

Môi trường nuôi cấy đếm chuẩn có thể được đánh giá bằng cách sử dụng các chủng đã biết đã được chứng nhận, chẳng hạn như: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Nếu môi trường nuôi cấy ở điều kiện tối ưu, sự tăng trưởng đạt yêu cầu được mong đợi trong mọi trường hợp, ngoại trừ L. fermentum, có thể có năng suất đều đặn.

Để đánh giá độ vô trùng của môi trường nuôi cấy, một hoặc hai đĩa của mỗi mẻ đã chuẩn bị (không cần cấy) phải được ủ ở 37 ° C trong môi trường hiếu khí trong 24 giờ. Sau thời gian này, không quan sát thấy sự phát triển hoặc thay đổi màu sắc trong môi trường.

Hạn chế

-Không đun chảy thạch nhiều lần.

- Môi trường đã chuẩn bị có thể để được đến 3 tháng miễn là nó được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng.

-Môi trường này không thích hợp cho vi sinh vật ưa khí hoặc kỵ khí.

Người giới thiệu

1. Cơ quan Quản lý Quốc gia về Thuốc, Thực phẩm và Công nghệ Y tế (ANMAT). Phân tích vi sinh thực phẩm, phương pháp phân tích chính thức, vi sinh vật chỉ thị. 2014 Tập 3. Có tại: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Đếm đĩa Agar. 2009 Có tại: http://f-soria.es
3. Phòng thí nghiệm Conda Pronadisa. Agar phương pháp chuẩn (PCA) theo APHA và ISO 4833. Có tại: condalab.com
4. Phòng thí nghiệm Britannia. Đếm đĩa thạch. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B và Velázquez O. 2009. Kỹ thuật phân tích vi sinh trong thực phẩm. Ấn bản thứ 2. Khoa Hóa học, UNAM. Mexico. Có tại: depa.fquim.unam