Các TCBS agar là một phương tiện văn hóa rắn tính chọn lọc cao và khác biệt, được sử dụng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn thuộc giống Vibrio, đặc biệt là Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus và V. vulnificus như mầm bệnh chủ yếu của loại hình này.
Từ viết tắt TCBS là viết tắt của Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Thạch này còn được gọi là môi trường chọn lọc Vibrios. Công thức ban đầu được tạo ra bởi Nakanishi và sau đó được sửa đổi bởi Kobayashi.
Môi trường TCBS thương mại và đĩa thạch TCBS được cấy vi khuẩn Vibrio cholerae. Nguồn: ảnh 1: do tác giả ThS. Marielsa Gil / Ảnh 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Ấn Độ
Nó bao gồm chiết xuất nấm men, peptone thịt, triptein, natri citrat, natri thiosulfat, mật bò, sucrose, natri clorua, citrat sắt, xanh bromothymol, xanh thymol và thạch.
Chế phẩm này cho phép sự phát triển đầy đủ của các loài Vibrio từ các mẫu nước, thức ăn và phân; ngoại trừ Vibrio hollisae, không phát triển trên môi trường này. Hơn nữa, môi trường TCBS có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác đi kèm, đặc biệt là coliform.
Do một số loài thuộc giống Vibrio gây ra các vấn đề nghiêm trọng về đường tiêu hóa và ngoài ruột, việc chẩn đoán xác định bệnh là rất quan trọng. Con người bị nhiễm bệnh chủ yếu do ăn thức ăn sống hoặc chưa nấu chín từ biển hoặc vùng nước ô nhiễm, nhưng cũng có thể lây nhiễm qua vết thương.
Do đó, các phòng thí nghiệm lâm sàng phải đưa thạch TCBS vào nghiên cứu cấy phân của các mẫu phân lỏng, đặc biệt là khi có sự xuất hiện của nước vo gạo. Đặc biệt nếu bệnh nhân cho biết đã tiếp xúc với nước biển hoặc ăn động vật có vỏ hoặc cá.
Nền tảng
Chiết xuất nấm men, pepton thịt và triptein là nguồn dinh dưỡng của môi trường này. Tuy nhiên, thạch TCBS là một môi trường không thích hợp với hầu hết các vi khuẩn.
Tính chọn lọc cao của nó được tạo ra bởi việc bổ sung natri citrat và mật bò; cả hai đều là tác nhân ức chế đồng thời cung cấp pH kiềm cho môi trường, hạn chế sự phát triển của hệ thực vật đi kèm và tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của V. cholerae, trong số các loài khác. Cần lưu ý rằng Vibrio cholerae rất nhạy cảm với độ chua.
Về phần mình, natri clorua cân bằng thẩm thấu môi trường. Hơn nữa, khi nồng độ của nó cao, nó cũng hoạt động như một tác nhân ức chế, tạo điều kiện cho sự phát triển của vi khuẩn ưa halogen.
Sucrose là đường có thể lên men, cùng với các chất chỉ thị pH xanh bromothymol và xanh thymol, tạo cho môi trường đặc tính khác biệt của nó. Vì lý do này, với môi trường này, có thể phân biệt các chủng lên men sucrose với các chủng không lên men.
Khuẩn lạc của các chủng lên men sacaroza phát triển có màu vàng và sẽ chuyển môi trường từ xanh sang vàng do sản xuất axit. Môi trường không lên men phát triển trong mờ và môi trường vẫn giữ màu ban đầu (xanh lục).
Tương tự như vậy, môi trường này chứa natri thiosunfat là nguồn cung cấp lưu huỳnh và xitrat sắt là chất phát triển. Cả hai đều cho thấy vi khuẩn có khả năng tạo ra hydrogen sulfide (khí không màu). H 2 S được tạo thành từ thiosunfat và sau đó khi phản ứng với xitrat sắt tạo thành kết tủa màu đen có thể nhìn thấy được.
Cuối cùng, thạch là thứ cung cấp độ đặc chắc cho môi trường.
Sự chuẩn bị
Cân 89 g môi trường đã khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Giúp hòa tan bằng cách đun nóng và khuấy thường xuyên. Hỗn hợp có thể được đun sôi trong tối đa 2 phút.
Môi trường này không được hấp tiệt trùng. Sau khi hòa tan, nó được phục vụ trực tiếp trên các đĩa vô trùng. Khi đông đặc, chúng được sắp xếp theo chiều ngược trên các tiểu cầu và bảo quản trong tủ lạnh (2-8 ° C) cho đến khi sử dụng.
Môi trường sau khi pha chế phải duy trì ở pH 8,6 ± 0,2.
Màu của môi trường khử nước là màu be nhạt hoặc màu be xanh lục, và màu của môi trường là xanh lục rừng hoặc xanh lục lam.
Điều quan trọng là phải để các đĩa ấm lên trước khi gieo mẫu.
Sử dụng
Mẫu xét nghiệm phổ biến nhất để phân lập Vibrios là phân tiêu chảy.
Các mẫu phân, nếu chúng không thể được gieo ngay trên môi trường chọn lọc, nên được vận chuyển trên môi trường Cary Blair.
Để tăng độ nhạy của môi trường nuôi cấy, phân có thể được cho qua nước peptone ở pH 8,4 làm môi trường tăng sinh trong thời gian tối đa là 8 giờ, từ đó nó được cấy truyền sang môi trường TCBS.
Cũng phải lưu ý rằng một số chủng vi khuẩn Vibrio có thể gây nhiễm trùng huyết ở những bệnh nhân bị ức chế miễn dịch, do đó chúng có thể được phân lập từ cấy máu. Tương tự như vậy, các mẫu nước và thức ăn từ biển có thể được phân tích khi có dịch bệnh tả.
Gieo
Chất cấy của mẫu nghiên cứu phải nổi rõ, việc gieo hạt được thực hiện theo phương pháp tạo vân bằng cách kiệt. Các đĩa được ủ ở 37 ° C trong 24 giờ trong môi trường hiếu khí.
Các khuẩn lạc giả định của Vibrio cholerae có kích thước trung bình, nhẵn, trắng đục, viền mỏng và có màu vàng do quá trình lên men của đường sucrose.
Các loài V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii và một số V. vulnificus phát triển theo cách tương tự. Các loài Vibrios quan trọng về mặt lâm sàng khác như V. parahaemolyticus không lên men đường sucrose, phát triển thành các khuẩn lạc màu xanh ô liu.
Đĩa thạch TCBS có hạt giống Vibrio parahaemolyticus. Nguồn: isis325 Flickr
Mặt khác, cần lưu ý rằng một số chủng Aeromonas và Plesiomonas là oxidase (+) có thể phát triển trong môi trường này, phát triển các khuẩn lạc màu vàng có thể gây nhầm lẫn cho bác sĩ lâm sàng. Trong khi một số chủng Pseudomonas cũng oxidase (+) phát triển dưới dạng khuẩn lạc màu xanh lục như V. parahaemolyticus.
Giới hạn
Thử nghiệm oxydase dương tính với chi Vibrio không bao giờ được thực hiện từ các khuẩn lạc thu được từ thạch TCBS, vì kết quả thu được sẽ là âm tính giả. Các hợp chất ở giữa gây trở ngại mạnh mẽ cho bài kiểm tra này. Do đó, nó phải được tạo ra từ các dịch cấy con trên thạch máu.
QA
Để chứng minh rằng môi trường ở trong tình trạng tốt, nên gieo các chủng đối chứng đã biết hoặc đã được chứng nhận, và quan sát xem sự phát triển có đáp ứng các đặc tính mong đợi hay không.
Đối với điều này, bạn có thể sử dụng các chủng:
-Vibrio cholerae -– sinh trưởng đạt yêu cầu (khuẩn lạc màu vàng, viền trong mờ).
-Vibrio parahaemolyticus --– sinh trưởng đạt yêu cầu (khuẩn lạc có tâm màu xanh lục và viền trong mờ).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - sinh trưởng đạt yêu cầu (khuẩn lạc màu vàng với quầng sáng cùng màu xung quanh khuẩn lạc).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - ức chế toàn bộ hoặc một phần (khuẩn lạc nhỏ màu vàng hoặc trong mờ).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– ức chế một phần hoặc toàn bộ (khuẩn lạc màu xanh).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Ức chế hoàn toàn.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Ức chế toàn bộ hoặc một phần. (Khuẩn lạc nhỏ màu xanh lục ở trung tâm mờ viền).
Việc ủ môi trường chưa cấy phải không thay đổi.
Người giới thiệu
- Phòng thí nghiệm Difco Francisco Soria Melguizo. Thạch TCBS. 2009. Có sẵn tại: f-soria.es
- Phòng thí nghiệm BD. BD. TCBS Agar 2003. Có sẵn tại: bd.com
- Phòng thí nghiệm Britannia. TCBS Trung bình. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
- Phòng thí nghiệm Acumedia. TCBS Agar. 2016. Có sẵn tại: Foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.