Các thạch EMB là một lựa chọn và vừa khác biệt dùng để phân lập nuôi cấy bán rắn của Gram âm trực khuẩn, đặc biệt là Enterobacteriaceae và vi khuẩn Gram âm khác undemanding. Nó còn được gọi bằng từ viết tắt EAM, viết tắt của eosin-methylene blue.
Môi trường này được tạo ra bởi Holt-Harris và Teague vào năm 1916. Nó chứa peptone, lactose, sucrose, dipotassium phosphate, agar, eosin, methylene blue, và nước. Nó rất giống với MacConkey Agar, đặc biệt là khi sử dụng Levine's Modified EMB Agar, không chứa sucrose.
Độ bóng kim loại của Escherichia coli trên thạch EMB Nguồn: Carmen Moreno González, từ Wikimedia Commons
Trên thực tế, mỗi phòng thí nghiệm quyết định làm việc với cái này hay cái kia, vì chúng thực hiện cùng một chức năng, mặc dù chúng khác nhau về mặt sinh hóa.
Nó thậm chí có nhược điểm tương tự như thạch MacConkey cổ điển về khả năng sản xuất bầy đàn của chi Proteus. Do đó, để tránh hiện tượng này, có thể tăng nồng độ thạch lên đến 5%.
Nền tảng
Chọn lọc
Thạch EMB có tính chọn lọc tinh tế vì nó chứa thuốc nhuộm anilin (eosin và xanh methylen), hoạt động như chất ức chế, ngăn chặn sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn Gram dương và một số que Gram âm khó tính.
Tuy nhiên, thạch này có nhược điểm là một số vi khuẩn Gram dương có thể chống lại sự hiện diện của các chất ức chế và phát triển thành các khuẩn lạc nhỏ không màu, chẳng hạn như Enterococcus faecalis và một số Staphylococcus.
Một số loại nấm men cũng có thể phát triển, chẳng hạn như phức hợp Candida albicans, sẽ tạo ra các khuẩn lạc rất nhỏ màu hồng. Chlamydospores thậm chí có thể phát triển từ nấm men này nếu mẫu được gieo hạt sâu.
Khác biệt
Mặt khác, thạch EMB cũng là một môi trường khác biệt, vì các thuốc nhuộm này cùng nhau (eosin và xanh methylen) có đặc tính tạo thành kết tủa ở pH axit, do đó chúng được coi là chất chỉ thị sản xuất của nó.
Do đó, vi khuẩn lên men lactose hoặc sucrose yếu tạo ra các khuẩn lạc màu tím trong vòng 24 đến 48 giờ. Ví dụ các chi Klebsiella, Enterobacter và Serratia.
Những vi khuẩn lên men mạnh lactose, chẳng hạn như Escherichia coli, hoặc sucrose, chẳng hạn như Yersinia enterocolitica hoặc Proteus penneri, tạo thành kết tủa màu đen xanh lục, tạo ra vẻ ngoài ánh kim loại đặc trưng ở những loài này.
Cần lưu ý rằng nếu sử dụng môi trường EMB levine (không có đường sucrose), Yersinia enterocolitica và Proteus penneri sẽ tạo ra các khuẩn lạc rõ ràng.
Vi khuẩn không lên men lactose hoặc sucrose được nuôi dưỡng bằng sự hiện diện của pepton, cung cấp axit amin và nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn, và tạo ra các khuẩn lạc rõ ràng. Ví dụ, các chi Salmonella và Shigella, trong số những loài khác.
Tương tự như vậy, điều quan trọng cần lưu ý là chi Acinetobacter có thể xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh oải hương, mặc dù nó không phải là chất lên men lactose hoặc sucrose, nhưng có đặc tính cố định xanh methylen trên thành tế bào của nó. Điều này cũng có thể xảy ra với các vi khuẩn oxy hóa khác.
Sự chuẩn bị
Môi trường khử nước ban đầu có màu be nhạt.
Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy này, phải cân 36 gam môi trường đã khử nước và lơ lửng trong bình có chứa một lít nước cất.
Sau khi để hỗn hợp nghỉ 5 phút, đưa bình ra nguồn nhiệt, trộn mạnh và liên tục cho đến khi sôi và tan hoàn toàn.
Sau đó, môi trường nuôi cấy đã hòa tan phải được khử trùng bằng nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút.
Khi hết thời gian, nó được lấy ra khỏi nồi hấp và để yên trong thời gian ngắn. Sau đó, vẫn còn ấm (45-50 ° C), 15-20 ml thạch được phục vụ trong mỗi đĩa Petri vô trùng. Môi trường phải có màu xanh quỳ tím.
Sau khi phục vụ, các đĩa được để hở một chút cho đến khi thạch hơi nguội. Sau đó chúng được bao phủ và để đông đặc hoàn toàn. Sau đó, chúng được sắp xếp trong khay đĩa ngược và bảo quản trong tủ lạnh (8 ° C) cho đến khi sử dụng.
Quy trình này được thực hiện tốt hơn trong tủ hút tầng hoặc trước vòi đốt Bunsen để tránh nhiễm bẩn.
Điều quan trọng cần lưu ý là mỗi nhà thương mại sẽ chỉ ra số lượng cần cân để chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
PH cuối cùng của môi trường phải là 7,2 ± 0,2
Các ứng dụng
Môi trường này được sử dụng để gieo nước tiểu và phân hoặc bất kỳ loại bệnh phẩm nào, đặc biệt nếu nghi ngờ có sự hiện diện của trực khuẩn Gram âm không khó tính, chẳng hạn như trực khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae phát triển rất tốt trên môi trường này.
Vi khuẩn đường ruột thuộc các giống Shigella và Salmonella được phân biệt bằng các khuẩn lạc không màu hoặc hơi hổ phách.
Các trực khuẩn lên men không lactose khác như Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, trong số những loại khác, cũng phát triển.
Tương tự như vậy, môi trường này rất hữu ích trong phân tích vi sinh vật của thực phẩm và nước, vì nó là lý tưởng cho giai đoạn khẳng định hoàn toàn của việc xác định coliform, nghĩa là, chứng thực sự hiện diện của E. coli từ nước dùng EC đục, từ của kỹ thuật số có thể xảy ra nhất (MPN).
QA
Để xác minh rằng môi trường nuôi cấy mới chuẩn bị hoạt động tốt, có thể cấy các chủng đối chứng để quan sát đặc điểm của các khuẩn lạc và xác minh rằng chúng cho kết quả như mong đợi.
Đối với điều này, có thể sử dụng các chủng ATCC hoặc các chủng E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa và một số vi khuẩn Gram dương, chẳng hạn như S. aureus, có thể được sử dụng.
E. coli dự kiến sẽ tạo ra các khuẩn lạc xanh đen phát triển tốt với ánh kim loại màu xanh lá cây. Trong khi đó, Enterobacter aerogenes và Klebsiella sp nên tạo ra các khuẩn lạc nhầy đen hơi xanh phát triển tốt.
Mặt khác, Salmonella typhimurium và Shigella flexneri, phải phát triển các khuẩn lạc lớn, không màu hoặc có màu hổ phách nhẹ.
Cuối cùng, chi Pseudomonas aeruginosa phát triển thành các khuẩn lạc không màu có kích thước không đều, trong khi vi khuẩn Gram dương nên bị ức chế hoàn toàn hoặc phát triển thưa thớt với các khuẩn lạc rất nhỏ.
Suy nghĩ cuối cùng
Đôi khi việc khử trùng làm giảm màu xanh methylen, có màu cam vừa. Để xanh metylen có thể oxi hóa và lấy lại màu tím thì phải trộn nhẹ cho đến khi lấy lại màu.
Ngoài ra, sau khi khử trùng, thuốc nhuộm có thể kết tủa, vì vậy cần trộn đều trước khi dùng đĩa Petri.
Người giới thiệu
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B và Velázquez O. 2009. Kỹ thuật phân tích vi sinh vật trong thực phẩm. Ấn bản thứ 2. Khoa Hóa học, UNAM. Mexico.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Đặc điểm và sự phân bố của các chủng Escherichia coli có khả năng gây bệnh được phân lập từ gà thịt từ các trang trại gia cầm ở Peru. Ông điều tra. bác sĩ thú y. Peru 2012 23 (2): 209-219. Có tại: scielo.org.
- Laboratorios Conda SA Eosin và Methylene Blue Agar. 2010. Có tại: condalab.com
- Phòng thí nghiệm Britannia. Levine EMB (Với Eosin và Methylene Blue) 2011. Có sẵn tại: britanialab.com
- Phòng thí nghiệm BD. BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar), Đã sửa đổi. 2013. Có sẵn tại: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Xuất bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Biên tập Panamericana SA