ENZYME HẠN CHẾ: CHỨC NĂNG, LOẠI VÀ VÍ DỤ - SINH HỌC - 2026

Các enzym hạn chế là các endonucleaza được sử dụng bởi một số vi khuẩn và vi khuẩn để ức chế hoặc "hạn chế" sự lây lan của vi rút bên trong. Chúng đặc biệt phổ biến ở vi khuẩn và là một phần của hệ thống phòng thủ chống lại DNA ngoại lai, được gọi là hệ thống hạn chế / sửa đổi.

Các enzym này xúc tác quá trình phân cắt DNA băng kép tại các vị trí cụ thể, có thể tái tạo và không cần sử dụng thêm năng lượng. Hầu hết yêu cầu sự hiện diện của các đồng yếu tố như magiê hoặc các cation hóa trị hai khác, mặc dù một số cũng yêu cầu ATP hoặc S-adenosyl methionine.

Sơ đồ phản ứng enzyme hạn chế HindIII (Nguồn: Helixitta qua Wikimedia Commons)

Các endonucleases hạn chế được phát hiện vào năm 1978 bởi Daniel Nathans, Arber Werner và Hamilton Smith, những người đã nhận giải Nobel y học cho khám phá của họ. Tên của chúng thường bắt nguồn từ sinh vật nơi chúng được quan sát lần đầu tiên.

Những enzym như vậy được sử dụng rộng rãi trong việc phát triển các phương pháp nhân bản DNA và các chiến lược sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền khác. Các đặc điểm nhận dạng trình tự cụ thể của chúng và khả năng cắt các trình tự gần với các vị trí nhận biết khiến chúng trở thành công cụ mạnh mẽ trong thí nghiệm di truyền.

Các đoạn được tạo ra bởi các enzym cắt giới hạn đã tác động lên một phân tử ADN cụ thể có thể được sử dụng để tạo lại "bản đồ" của phân tử ban đầu bằng cách sử dụng thông tin về các vị trí mà enzym cắt ADN.

Một số enzym giới hạn có thể có cùng vị trí nhận dạng trên DNA, nhưng chúng không nhất thiết phải cắt nó theo cùng một cách. Do đó, có những enzym cắt để lại những đầu cùn và những enzym cắt để lại những đầu dính, có những ứng dụng khác nhau trong sinh học phân tử.

Hiện nay có hàng trăm loại enzyme hạn chế thương mại khác nhau, được cung cấp bởi các nhà thương mại khác nhau; Các enzym này có chức năng như những chiếc kéo phân tử "tùy chỉnh" cho các mục đích khác nhau.

Đặc trưng

Các enzym hạn chế hoàn thành chức năng ngược lại của polymerase, vì chúng thủy phân hoặc phá vỡ liên kết este trong liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề trong chuỗi nucleotide.

Trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền, chúng là những công cụ được sử dụng rộng rãi để xây dựng các vectơ biểu hiện và nhân bản, cũng như để xác định các trình tự cụ thể. Chúng cũng hữu ích cho việc xây dựng các bộ gen tái tổ hợp và có tiềm năng công nghệ sinh học lớn.

Những tiến bộ gần đây trong liệu pháp gen làm cho việc sử dụng các enzym giới hạn hiện nay để đưa các gen cụ thể vào vectơ là phương tiện vận chuyển các gen đó vào tế bào sống và có thể có khả năng chèn vào bộ gen tế bào để thực hiện những thay đổi vĩnh viễn.

Cơ chế hoạt động

Các enzym giới hạn có thể xúc tác sự phân cắt DNA băng kép, mặc dù một số có khả năng nhận biết trình tự DNA băng đơn và thậm chí cả RNA. Việc cắt xảy ra sau khi nhận ra các trình tự.

Cơ chế hoạt động bao gồm sự thủy phân liên kết phosphodiester giữa một nhóm phosphate và một deoxyribose trong khung của mỗi sợi DNA. Nhiều enzym có khả năng cắt tại cùng một vị trí mà chúng nhận ra, trong khi những enzym khác cắt từ 5 đến 9 cặp bazơ trước hoặc sau nó.

Thông thường các enzym này cắt ở đầu 5 'của nhóm photphat, tạo ra các đoạn DNA có đầu 5' là phosphoryl và đầu là hydroxyl ở đầu 3 '.

Vì các protein không tiếp xúc trực tiếp với vị trí nhận dạng trong DNA, chúng phải được chuyển vị liên tiếp cho đến khi đạt được vị trí cụ thể, có lẽ bằng cơ chế "trượt" trên sợi DNA.

Trong quá trình phân cắt bằng enzym, liên kết phosphodiester của mỗi sợi DNA được định vị trong một trong những vị trí hoạt động của enzym giới hạn. Khi enzyme rời khỏi vị trí nhận biết và phân cắt, nó thực hiện thông qua các liên kết thoáng qua không đặc hiệu.

Các loại

Năm loại enzym giới hạn hiện được biết đến. Dưới đây là mô tả ngắn gọn về từng cái:

Enzyme giới hạn loại I

Các enzym này là các protein pentameric lớn với ba tiểu đơn vị, một để giới hạn, một để metyl hóa và một để nhận dạng trình tự trong DNA. Các endonuclease này là các protein đa chức năng có khả năng xúc tác các phản ứng hạn chế và sửa đổi, chúng có hoạt tính ATPase và cả DNA topoisomerase.

Enzyme loại này là endonuclease đầu tiên được phát hiện, chúng được tinh chế lần đầu tiên vào những năm 1960 và đã được nghiên cứu rất sâu kể từ đó.

Enzyme loại I không được sử dụng rộng rãi như một công cụ công nghệ sinh học, vì vị trí phân cắt có thể ở khoảng cách thay đổi lên đến 1.000 cặp bazơ từ vị trí nhận dạng, điều này làm cho chúng không đáng tin cậy về khả năng tái tạo thực nghiệm.

Enzyme giới hạn loại II

Chúng là các enzym bao gồm các homodime hoặc tetrame cắt DNA tại các vị trí xác định có chiều dài từ 4 đến 8 bp. Các vị trí phân cắt này thường là palindromic, tức là chúng nhận ra các trình tự được đọc theo cùng một cách theo cả hai hướng.

Nhiều enzym giới hạn loại II ở vi khuẩn cắt ADN khi chúng nhận ra đặc tính ngoại lai của nó, vì nó không có những sửa đổi điển hình mà ADN của chính nó phải có.

Đây là những enzym giới hạn đơn giản nhất vì chúng không yêu cầu bất kỳ đồng yếu tố nào ngoài magiê (Mg +) để nhận biết và cắt chuỗi DNA.

Độ chính xác của enzym giới hạn loại II trong việc nhận biết và cắt các trình tự đơn giản trong DNA tại các vị trí chính xác khiến chúng trở thành một trong những enzym được sử dụng rộng rãi nhất và không thể thiếu trong hầu hết các ngành của sinh học phân tử.

Trong nhóm enzym giới hạn loại II có nhiều phân lớp được phân loại theo các đặc tính nhất định riêng cho từng phân lớp. Việc phân loại các enzym này được thực hiện bằng cách thêm các chữ cái trong bảng chữ cái, từ A đến Z theo tên của enzym.

Một số lớp con được biết đến nhiều nhất về tính hữu dụng của chúng là:

Phân lớp IIA

Chúng là dimer của các đơn vị con khác nhau. Chúng nhận ra các trình tự không đối xứng và được sử dụng làm tiền chất lý tưởng cho việc tạo ra các enzym cắt.

Phân lớp IIB

Chúng được tạo thành từ một hoặc nhiều dimer và cắt DNA ở cả hai phía của trình tự nhận dạng. Chúng cắt cả hai sợi DNA một khoảng cặp base trước vị trí nhận dạng.

IIC lớp con

Enzyme loại này là polypeptide có chức năng phân chia và sửa đổi sợi DNA. Các enzym này cắt cả hai sợi không đối xứng.

Phân lớp IIE

Các enzym của phân lớp này được sử dụng nhiều nhất trong kỹ thuật di truyền. Chúng có một vị trí xúc tác và thường yêu cầu một chất tạo hiệu ứng allosteric. Các enzym này cần tương tác với hai bản sao của trình tự nhận dạng của chúng để thực hiện quá trình phân cắt hiệu quả. Trong phân lớp này là các enzym EcoRII và EcoRI.

Enzyme giới hạn loại III

Các endonuclease giới hạn loại III chỉ bao gồm hai tiểu đơn vị, một đơn vị chịu trách nhiệm nhận dạng và sửa đổi DNA, trong khi đơn vị kia chịu trách nhiệm phân cắt trình tự.

Các enzym này yêu cầu hai đồng yếu tố cho chức năng của chúng: ATP và magiê. Các enzym giới hạn thuộc loại này có hai vị trí nhận dạng không đối xứng, chuyển vị DNA theo cách phụ thuộc vào ATP và cắt nó trong khoảng 20-30 bp liền kề với vị trí nhận dạng.

Enzyme giới hạn loại IV

Enzyme loại IV rất dễ nhận biết khi chúng cắt DNA bằng các dấu methyl hóa, chúng được tạo thành từ một số tiểu đơn vị khác nhau có nhiệm vụ nhận biết và cắt chuỗi DNA. Các enzym này sử dụng GTP và magiê hóa trị hai làm đồng yếu tố.

Các vị trí phân cắt cụ thể bao gồm các sợi nucleotide có gốc cytosine được methyl hóa hoặc hydroxymethyl hóa trên một hoặc cả hai sợi của axit nucleic.

Enzyme giới hạn loại V

Phân loại này nhóm các enzym loại CRISPER-Cas, xác định và cắt các trình tự DNA cụ thể khỏi các sinh vật xâm nhập. Enzyme Cas sử dụng một sợi RNA dẫn đường được tổng hợp CRISPER để nhận biết và tấn công các sinh vật xâm nhập.

Các enzym được phân loại là loại V là các polypeptit được cấu trúc bởi các enzym loại I, II và II. Chúng có thể cắt các đoạn DNA của hầu hết mọi sinh vật với chiều dài rất đa dạng. Tính linh hoạt và dễ sử dụng của chúng làm cho các enzym này trở thành một trong những công cụ được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật di truyền ngày nay, cùng với các enzym loại II.

Ví dụ

Các enzym giới hạn đã được sử dụng để phát hiện các đa hình DNA, đặc biệt là trong các nghiên cứu di truyền quần thể và các nghiên cứu tiến hóa bằng cách sử dụng DNA ty thể, nhằm thu được thông tin về tốc độ thay thế nucleotide.

Hiện tại, các vectơ được sử dụng để biến nạp vi khuẩn cho các mục đích khác nhau có các vị trí đa nhân nơi tìm thấy các vị trí nhận dạng cho nhiều enzym giới hạn.

Trong số các enzym này, phổ biến nhất là EcoRI, II, III, IV và V, được thu nhận và mô tả lần đầu tiên từ E. coli; HindIII từ H. influenzae và BamHI từ B. amyloliquefaciens.

Người giới thiệu

1. Bickle, TA, & Kruger, DH (1993). Sinh học Giới hạn DNA. Đánh giá vi sinh, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR Cung cấp khả năng chống lại virus ở sinh vật nhân sơ. Science, 315 (tháng 3), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Quan điểm phân tử: Hạn chế Endonucleases. Nguyên tắc cơ bản về tế bào gốc của y học ung thư, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Nhảy, nhảy và lặp lại bởi các enzym giới hạn. Giao dịch xã hội sinh hóa, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Duy trì nhận dạng loài và kiểm soát đặc điểm của vi khuẩn: một chức năng mới cho hệ thống hạn chế / sửa đổi? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin Genes XII (12 ấn bản). Burlington, Massachusetts: Học tập Jones & Bartlett.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Khai thác hệ thống CRISPR-Cas loại I và loại III để chỉnh sửa bộ gen. Nghiên cứu axit nucleic, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA và Wilson, GG (2013). Enzyme hạn chế loại I và họ hàng của chúng. Nghiên cứu axit nucleic, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Hạn chế Endonucleases trong phân tích và tái cấu trúc phân tử DNA. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Đa hình dna có thể được phát hiện bằng endonuclease hạn chế. Di truyền học, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Khoa học sự sống tế bào và phân tử endonuclease giới hạn loại II: cấu trúc và cơ chế. CMLS Khoa học Sự sống Tế bào và Phân tử, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Làm thế nào các enzym giới hạn trở thành con ngựa của sinh học phân tử. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ & Murray, K. (1976). Hạn chế endonucleases. Đánh giá quan trọng trong Hóa sinh, (tháng 11), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Cấu trúc và chức năng của endonuclease Homing. Đánh giá Hàng quý về Lý sinh, 1–47.
15. Tock, MR, & Dryden, DTF (2005). Sinh học của hạn chế và chống hạn chế. Ý kiến ​​hiện tại trong vi sinh vật học, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG và Murray, NE (1991). Hệ thống hạn chế và sửa đổi. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., & Mou, K. (2016). Hiểu biết bộ gen về độc lực của Campylobacter jejuni và di truyền quần thể. Infec. Dis. Bản dịch. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Cấu trúc và Cơ chế của Endonuclease Hạn chế Đa chức năng. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.