DNA TÁI TỔ HỢP: KỸ THUẬT, ỨNG DỤNG VÀ NGUYÊN TẮC CƠ BẢN - SINH HỌC - 2026

Các DNA tái tổ hợp (rDNA hoặc rDNA) là một phân tử axit nucleic nhân tạo được tạo ra trong phòng thí nghiệm, bằng cách tích hợp hai phân đoạn của các tổ chức quan tâm. Nó còn được gọi là DNA chimeric, nhờ đặc tính lai của nó. Loại DNA này không được tìm thấy trong tự nhiên.

Phương pháp cơ bản để tạo ra nó bao gồm: (a) lựa chọn DNA đích và chèn nó vào một đoạn DNA khác (thường là plasmid của vi khuẩn); (b) đưa plasmid này vào vi khuẩn, (c) chọn lọc vi khuẩn bằng kháng sinh và cuối cùng là (d) biểu hiện gen.

Nguồn: pixabay.com

Kỹ thuật này tận dụng một tập hợp các enzym giúp sao chép và dán các đoạn DNA cụ thể theo nhận định của nhà nghiên cứu.

Mục tiêu của công nghệ tái tổ hợp, trong hầu hết các trường hợp, là sự biểu hiện của một protein (được gọi là protein tái tổ hợp) mà nhà sinh học phân tử mong muốn cho nghiên cứu trong tương lai hoặc để tạo ra một loại protein có giá trị thương mại và điều trị - chẳng hạn như insulin người, ví dụ.

Khái niệm cơ bản về kỹ thuật DNA tái tổ hợp và việc sử dụng nó trong kỹ thuật di truyền

Giáo điều trung tâm của sinh học phân tử

Tất cả các sinh vật hữu cơ mà chúng ta biết đều có chung một số đặc điểm. Một trong số đó là bản chất của vật chất di truyền và cách thức tạo ra protein - một quá trình được gọi là "giáo điều" trung tâm của sinh học phân tử.

Ngoại trừ một số virut, tất cả các sinh vật đều lưu trữ thông tin di truyền trong DNA (axit deoxyribonucleic), được thu thập một cách rất chặt chẽ và có tổ chức trong nhân tế bào.

Để biểu hiện gen, phân tử ADN được phiên mã thành ARN thông tin, và phân tử sau được dịch sang ngôn ngữ của axit amin, các khối cấu tạo của protein.

DNA tái tổ hợp là gì?

Giữa những năm 1970 và 1980, các nhà sinh học phân tử bắt đầu tận dụng các quá trình xảy ra tự nhiên bên trong tế bào và có thể ngoại suy chúng trong phòng thí nghiệm.

Bằng cách này, một gen có nguồn gốc động vật (chẳng hạn như động vật có xương sống) có thể được chèn vào một đoạn DNA của vi khuẩn; hoặc DNA của vi khuẩn có thể kết hợp với DNA của virus. Do đó, chúng ta có thể định nghĩa DNA tái tổ hợp là một phân tử được tạo thành từ DNA từ hai sinh vật khác nhau.

Khi phân tử lai hoặc tái tổ hợp này đã được tạo ra, gen quan tâm sẽ được biểu hiện. Với từ biểu chúng tôi muốn nói đến quá trình dịch mã thành protein.

Enzyme hạn chế và ligase: chìa khóa của quá trình

Yếu tố quan trọng trong việc phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp là việc phát hiện ra các enzym giới hạn.

Đây là những phân tử protein thể hiện khả năng phân cắt DNA (nuclease) thành các trình tự cụ thể, đóng vai trò như “chiếc kéo phân tử”. Các đoạn được tạo ra bởi các enzym này được gọi là các đoạn giới hạn.

Các enzym cho biết có thể tạo ra các vết cắt đối xứng trong trình tự đích (trong cả hai chuỗi ở cùng độ cao) hoặc các vết cắt không đối xứng. Khía cạnh quan trọng của hoạt động của các enzym giới hạn là sau khi các chuỗi phân cắt, một "cạnh lỏng lẻo" sẽ thu được, bổ sung cho cạnh còn lại được cắt bởi cùng một enzym.

Một số ví dụ là ECOR 1 và Sma 1. Hiện nay hơn 200 loại enzym giới hạn đã được biết đến và có sẵn trên thị trường.

Để trở nên hữu ích, một chiếc kéo phải đi kèm với keo. Hoạt động niêm phong này của DNA (trước đó đã được xử lý bằng các enzym giới hạn) được thực hiện bởi các ligase.

Kỹ thuật: DNA của một sinh vật được biến đổi nhân tạo trong phòng thí nghiệm như thế nào?

Dưới đây chúng tôi sẽ mô tả các bước chính mà công nghệ DNA tái tổ hợp yêu cầu. Tất cả đều được thực hiện bởi các chuyên gia trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử.

"Nhân bản" là gì?

Trước khi tiếp tục với quy trình thử nghiệm, chúng ta phải lưu ý rằng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học, thuật ngữ "nhân bản" và động từ "nhân bản" được sử dụng rộng rãi. Điều này có thể dẫn đến nhầm lẫn.

Trong bối cảnh này, chúng tôi không đề cập đến việc nhân bản toàn bộ sinh vật (ví dụ như trường hợp của chú cừu Dolly nổi tiếng), mà là việc nhân bản một đoạn DNA, có thể là một gen. Đó là, tạo ra nhiều bản sao - giống hệt nhau về mặt di truyền - của trình tự.

1. Phân lập và lấy DNA

Bước đầu tiên là quyết định trình tự bạn muốn sử dụng. Điều này hoàn toàn phụ thuộc vào nhà nghiên cứu và mục tiêu công việc của anh ta. DNA này sau đó phải được phân lập và tinh khiết. Các phương pháp và quy trình để đạt được điều này lần lượt phụ thuộc vào cơ thể và mô.

Nói chung, một phần mô được lấy và xử lý trong dung dịch đệm ly giải với proteinase K (một loại enzyme phân giải protein) và sau đó DNA được chiết xuất. Sau đó, vật liệu di truyền bị phân mảnh thành các mảnh nhỏ.

2. Nhân bản vector

Sau các bước chuẩn bị, nhà nghiên cứu tìm cách đưa đoạn DNA quan tâm vào vector nhân bản. Từ bây giờ chúng ta sẽ gọi đây là đoạn DNA trắng.

Plasmid

Một trong những vector được sử dụng nhiều nhất trong plasmid có nguồn gốc vi khuẩn. Plasmid là một phân tử DNA mạch kép, vòng tròn được tìm thấy tự nhiên trong vi khuẩn. Chúng lạ với nhiễm sắc thể vi khuẩn - nghĩa là chúng là ngoại nhiễm sắc thể và được tìm thấy tự nhiên trong các sinh vật nhân sơ này.

Các yếu tố cơ bản của vector là: (a) nguồn gốc của sự sao chép, cho phép tổng hợp DNA; (b) tác nhân chọn lọc, giúp xác định các sinh vật mang plasmid với DNA mục tiêu, chẳng hạn như kháng một số loại kháng sinh; và (c) vị trí đa nhân, nơi tìm thấy các trình tự sẽ được nhận biết bởi các enzym giới hạn.

DNA tái tổ hợp thành công đầu tiên trong phòng thí nghiệm được nhân bản vào plasmid pSC101 từ vi khuẩn E. coli. Nó chứa một vị trí hạn chế đối với enzym giới hạn EcoRI và một gen kháng thuốc kháng sinh, ngoài nguồn gốc của sự sao chép.

Việc chèn DNA đích vào plasmid được thực hiện bằng cách sử dụng các công cụ phân tử của các enzym giới hạn và các ligase đã được mô tả trong phần trước.

Các loại vectơ còn lại

Ngoài plasmid, DNA có thể được chèn vào vector khác, chẳng hạn như thực khuẩn lambda, cosmids, YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men), BAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn) và phagemid.

3. Giới thiệu DNA tái tổ hợp

Sau khi thu được phân tử DNA tái tổ hợp (gen quan tâm đến plasmid hoặc vector khác), nó được đưa vào vật chủ hoặc sinh vật chủ, có thể là vi khuẩn.

Để đưa DNA ngoại lai vào vi khuẩn, một kỹ thuật gọi là biến nạp vi khuẩn được sử dụng, trong đó sinh vật được xử lý bằng các cation hóa trị hai khiến nó dễ bị nhiễm DNA.

Về mặt phương pháp, chúng tôi không thể đảm bảo rằng 100% vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy của chúng tôi đã sử dụng hiệu quả phân tử DNA tái tổ hợp của chúng tôi. Đây là nơi phát huy tác dụng của phần plasmid có chứa kháng kháng sinh.

Như vậy, vi khuẩn đã chiếm plasmid sẽ kháng lại một loại kháng sinh nào đó. Để chọn chúng, chỉ cần áp dụng loại kháng sinh đã nói và lấy những người sống sót là đủ.

4. "Thu hoạch" protein

Sau khi chọn vi khuẩn có DNA tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành sử dụng máy móc enzym của vật chủ để tạo ra sản phẩm protein quan tâm. Khi vi khuẩn sinh sản, plasmid được truyền cho thế hệ con của chúng, vì vậy nó không bị mất đi trong quá trình phân chia.

Quy trình này sử dụng vi khuẩn như một loại "nhà máy" protein. Sau đó, chúng ta sẽ thấy rằng nó là một thủ tục rất phù hợp trong việc phát triển các phương pháp điều trị y tế hiệu quả.

Khi quá trình nuôi cấy đã sẵn sàng và vi khuẩn đã tạo ra một lượng lớn protein, tế bào sẽ bị ly giải hoặc phá vỡ. Có một loạt các kỹ thuật sinh hóa cho phép tinh chế protein theo các đặc điểm hóa lý của chúng.

Trong một bối cảnh thử nghiệm khác, chúng tôi có thể không quan tâm đến việc tạo ra protein, nhưng chúng tôi quan tâm đến việc thu được trình tự DNA. Nếu đúng như vậy, plasmid sẽ được sử dụng để tạo ra nhiều bản sao của đoạn quan tâm nhằm có đủ DNA mục tiêu để thực hiện các thí nghiệm liên quan.

Các ứng dụng

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở ra vô số khả năng trong sinh học phân tử, công nghệ sinh học, y học và các lĩnh vực liên quan khác. Những ứng dụng nổi bật nhất của nó sau đây.

Phân tích di truyền

Ứng dụng đầu tiên liên quan trực tiếp đến các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép các nhà nghiên cứu hiểu được chức năng bình thường của gen và các protein được tạo ra có thể được sử dụng trong các nghiên cứu sâu hơn.

Ngành công nghiệp dược phẩm

Protein được sản xuất bằng quy trình tái tổ hợp DNA có ứng dụng trong y học. Hai ví dụ rất phù hợp trong lĩnh vực này là insulin người và hormone tăng trưởng, được áp dụng cho những bệnh nhân thiếu protein này.

Nhờ DNA tái tổ hợp, các protein này có thể được tạo ra mà không cần phải chiết xuất chúng từ một người khác, điều này thể hiện các biến chứng phương pháp luận và rủi ro sức khỏe bổ sung. Điều này đã giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của vô số bệnh nhân.

Người giới thiệu

1. Baca, LEL & Álvarez, CLC (2015). Sinh học 2. Grupo biên tập Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE & Hausman, RE (2000). Tế bào: một cách tiếp cận phân tử (Quyển 10). Washington, DC: Báo chí ASM.
3. Devlin, TM (2004). Hóa sinh: sách giáo khoa với các ứng dụng lâm sàng. Tôi đã đảo ngược.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Vai trò của Công nghệ DNA tái tổ hợp để cải thiện cuộc sống. Tạp chí gen quốc tế, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Giải phẫu bệnh lý. Elsevier Tây Ban Nha.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Giới thiệu về vi sinh vật học. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Insulin người: Thuốc đầu tiên của công nghệ DNA. Tạp chí Y tế Hệ thống Dược của Mỹ, 46 (11_suppl), S9-S11.