MÜELLER HINTON AGAR: CƠ SỞ, CHUẨN BỊ VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2025

Các Mueller Hinton Agar là không có chọn lọc, môi trường dinh dưỡng rắn gồm truyền thịt, peptone casein axit, tinh bột, agar và nước cất. Môi trường này cho phép vi sinh vật phát triển tuyệt vời đối với hầu hết các vi khuẩn phát triển nhanh.

Ban đầu nó được tạo ra bởi John Howard Müeller và Jane Hinton để phân lập vi khuẩn đòi hỏi dinh dưỡng như Neisseria gonorrhoeae và Neisseria meningitidis. Tuy nhiên, do các đặc tính của nó, nó trở nên lý tưởng cho việc nghiên cứu tính nhạy cảm với kháng sinh, mang lại kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo.

Antibiogram (thạch Müeller Hinton). Nguồn: Dr Graham Beards tại en.wikipedia

Do đó, thạch Müeller Hinton là môi trường nuôi cấy được chấp nhận bởi Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI) và Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm Tính nhạy cảm với Kháng sinh, để thực hiện thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa Kirby và Bauer.

Nền tảng

Là một môi trường dinh dưỡng không chọn lọc, nó rất tốt cho sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn gây bệnh.

Mặt khác, thành phần đơn giản của nó làm cho các chất dễ dàng khuếch tán trên nó, là một đặc điểm cần thiết cho phép thử độ nhạy bằng phương pháp khuếch tán đĩa.

Một đặc điểm khác của nó là nó chứa một lượng chất ức chế thấp, cho phép đánh giá hiệu quả sulfonamid, trimethoprim và tetracyclin.

Tuy nhiên, cần lưu ý rằng phương tiện phải đáp ứng các điều kiện nhất định để đảm bảo hoạt động bình thường của nó, bao gồm:

Việc điều chỉnh pH, ​​độ sâu của thạch và nồng độ thymine, thymidine, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ và Zn ^{++ thích hợp} .

Bạn cũng phải biết rằng phương pháp này được chuẩn hóa và do đó tất cả các tham số phải được đáp ứng, chẳng hạn như:

Nồng độ chất cấy, nồng độ và sự bảo tồn của các đĩa kháng sinh, vị trí của số lượng đĩa thích hợp trên thạch, khoảng cách giữa đĩa này và đĩa khác, vị trí chiến lược của một số loại kháng sinh, không khí, nhiệt độ và thời gian ủ.

Sự chuẩn bị

Cân 37 g môi trường Müeller Hinton đã khử nước và hòa tan trong 1 lít nước cất. Vừa đun vừa khuấy môi trường để hỗ trợ hòa tan. Đun sôi trong 1 phút.

Hấp tiệt trùng ở 121 ° C trong 15 phút. Khi lấy ra khỏi nồi hấp, phải đặt bình vào nồi cách thủy ở 50oC để làm nguội. Rót 25 đến 30 ml vào đĩa Petri đường kính 10 cm vô trùng.

Các tấm phải có độ dày trung bình là 4 mm (lý tưởng), phạm vi cho phép là 3-5 mm.

Nếu muốn chuẩn bị thạch máu bằng cách sử dụng thạch Müeller Hinton làm cơ sở, hãy đổ 5% máu cừu đã khử trùng và khử trùng trước khi cho vào đĩa.

PH cuối cùng của môi trường phải từ 7,2 đến 7,4.

Đầu tư và bảo quản trong tủ lạnh, cho đến khi sử dụng. Để đĩa về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

Màu của môi trường đã chuẩn bị là màu be nhạt.

Các ứng dụng

Nó được sử dụng để thực hiện kháng sinh đồ hoặc kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh đối với hầu hết các mầm bệnh không đòi hỏi phát triển nhanh.

Nếu thạch được bổ sung với máu, nó được sử dụng để thực hiện phản đồ của các vi sinh vật đòi hỏi như: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, và các loại khác. Nó cũng đã được sử dụng để phân lập Legionella pneumophila.

Kỹ thuật phản đồ

Trước khi thực hiện phản đồ, phải chuẩn bị dung dịch vi khuẩn tương đương với 1,5 x 10 ⁸ tế bào.

Đối với điều này, 3 đến 4 khuẩn lạc của mẫu cấy tinh khiết được lấy và lơ lửng trong môi trường men đậu tương hoặc trong môi trường Müeller Hinton, ủ trong 2 đến 6 giờ và nồng độ được điều chỉnh bằng dung dịch muối vô trùng, so sánh với tiêu chuẩn Mac Farland của 0,5%.

Nếu chúng là vi sinh vật yêu cầu, các khuẩn lạc có thể được lơ lửng trực tiếp với nồng độ 0,5% Mac Farland. Sau đó, đĩa Müeller Hinton được cấy bằng một miếng gạc tẩm dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị.

Để làm điều này, miếng gạc được nhúng vào dung dịch và sau đó chất lỏng dư thừa được loại bỏ bằng cách ấn vào thành ống. Ngay sau đó, miếng gạc được đưa qua toàn bộ bề mặt, không để sót chỗ nào, sau đó đĩa được xoay nhẹ và nó được gieo hạt một lần nữa. Thao tác lặp lại thêm 2 lần nữa.

Để yên trong 10 phút rồi dùng kẹp vô trùng chèn các đĩa kháng sinh vào, để lại khoảng cách giữa chúng là 24 mm. Sau khi đặt từng đĩa lên thạch, dùng kẹp ấn nhẹ vào từng đĩa để đảm bảo chúng bám dính tốt.

Khi quá trình kết thúc, đĩa được đảo ngược và ủ ở 35-37 ° C trong môi trường hiếu khí từ 16 đến 18 giờ. Nếu đó là một vi sinh vật có nhu cầu, nó có thể là vi sinh vật ưa thích và nếu kháng sinh đồ chứa các đĩa oxacillin, nó nên được đọc sau 24 giờ.

Một cái thước được dùng để đo đường kính của mỗi vầng hào quang. Kết quả phải được ghi lại bằng mm. Sau đó, các giá trị thu được tương quan với các bảng điểm giới hạn được xuất bản bởi sổ tay CLSI hiện hành.

Đo quầng ức chế. Nguồn: USCDCP, Pixnio.com

Báo cáo là nhạy cảm (S), trung gian (I) hoặc kháng (R), tùy từng trường hợp.

Thuốc kháng sinh được lựa chọn tùy theo vi sinh vật được phân lập và loại nhiễm trùng mà nó đang tạo ra.

Đôi khi phải ghi nhớ vị trí chiến lược của thuốc kháng sinh để phát hiện ra các kiểu hình kháng thuốc.

Vị trí đĩa chiến lược trên thạch Müeller Hinton

Đối với vi khuẩn đường ruột, nên đặt đĩa axit clavulanic chống lại cephalosporin thế hệ thứ 3 và thứ 4. Sự mở rộng hình trứng chỉ ra rằng chủng này là sản xuất của beta-lactamase phổ mở rộng (ESBL). Điều này có nghĩa là bệnh nhân không nên được điều trị bằng bất kỳ cephalosporin nào.

Biểu hiện kiểu hình của sản xuất beta-lactamase phổ mở rộng (ESBL) ở dòng Escherichia coli. Nguồn: Ảnh do tác giả ThS. Marielsa gil

Ở Staphylococcus, điều quan trọng là phải đặt đĩa erythromycin hoặc azithromycin trước đĩa clindamycin (xét nghiệm D).

Quầng kháng erythromycin và vầng hào quang clindamycin phẳng cho thấy chủng có khả năng kháng clindamycin (ICR) do chủng gây ra. Điều này có nghĩa là điều trị bằng clindamycin sẽ không hiệu quả.

Để tìm kiếm các chủng AMP C cảm ứng trong Enterobacteriaceae và một số thanh Gram âm không lên men, tazobactan ceftazidime, cefoxitin hoặc piperacillin được đặt đối diện với đĩa imipenem, ở khoảng cách 27 mm.

Vầng hào quang dẹt ở một trong các đĩa đối diện với imipenem cho biết sự hiện diện của AMP C cảm ứng.

Để tìm kiếm C-AMP cấu tạo, đĩa cloxacillin 500 µg được đối mặt với ceftazidime (30 µg) và với cefotaxime (30 µg), ở khoảng cách 25 mm. Vầng hào quang mở rộng ở bất kỳ cephalosporin nào cho thấy tính tích cực.

Đĩa cloxacillin cũng có thể được thay thế bằng đĩa 9 mm giấy lọc Whatman số 6 có tẩm axit phenyl boric (400 µg) với khoảng cách 18 mm. Nó được giải thích giống như phần trước.

Cuối cùng, để điều tra việc sản xuất metallobetalactamase, đặc biệt là ở Pseudomonas aeruginosa, người ta sử dụng đĩa được ngâm tẩm với 10 µl axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA 750 µg) và axit thioglycolic (SMA 300 µg), đối ứng với đĩa imipenem và meropenem, ở khoảng cách 15 mm.

Kết quả xét nghiệm là dương tính nếu có sự mở rộng của quầng sáng imipenem hoặc meropenem về phía đĩa EDTA / SMA. Kết quả này phải được xác nhận bằng thử nghiệm Hodge đã sửa đổi.

Phương pháp này bao gồm việc cấy chủng Escherichia coli ATCC 25922 vào đĩa Müeller Hinton. Một đĩa imipenem được đặt ở trung tâm của đĩa và sau đó một vệt được tạo từ đĩa ra ngoại vi với chủng P. aeruginosa nghi ngờ. Có thể kiểm tra tối đa 4 chủng trên mỗi đĩa.

Thử nghiệm sẽ dương tính nếu có vùng biến dạng của quầng imipenem xung quanh vết rạn.

Nguyên nhân của kết quả sai

- Đĩa kháng sinh được bảo quản không tốt có thể tạo ra kháng giả. Ví dụ, đĩa oxacillin rất dễ bị thay đổi nhiệt độ.

-Một độ pH của môi trường dưới chỉ định (có tính axit) tạo ra quầng sáng nhỏ hơn trong aminoglycosid và macrolid (nguy cơ kháng giả), và quầng sáng lớn hơn trong penicilin, tetracycline và novobiocin (nguy cơ nhạy cảm giả).

-Nếu độ pH cao hơn cho thấy (kiềm), các tác động được mô tả ở trên sẽ bị đảo ngược.

-Media có nồng độ thymine và thymidine cao có ảnh hưởng bằng cách làm giảm đáng kể quầng sáng ức chế của sulfonamid và trimethoprim.

- Nồng độ canxi và magiê cao tạo ra sự đề kháng giả của các aminoglycoside, polymyxin B và tetracycline chống lại các chủng Pseudomonas aeruginosa.

- Nồng độ canxi và magiê thấp tạo ra sự nhạy cảm giả của aminoglycoside, polymyxin B và tetracyclines chống lại các chủng Pseudomonas aeruginosa.

-Sự hiện diện của kẽm ảnh hưởng đến kết quả của đĩa carbapenem (imipenem, meropenem và ertapenem).

-Độ dày của môi trường dưới 3mm sẽ cho kết quả độ nhạy giả, trong khi độ dày trên 5 sẽ tạo ra độ nhạy giả.

- Sự vận động của các đĩa trong phản đồ sẽ tạo ra quầng sáng bị biến dạng, vì việc thải kháng sinh là ngay lập tức.

- Chất cấy rất yếu ảnh hưởng đến kết quả, vì sẽ không có sự phát triển đồng đều hoặc hợp lưu trong thạch, điều kiện cần thiết để có thể đo được các quầng ức chế, ngoài ra các quầng có thể cho lớn hơn bình thường.

- Chất cấy quá tải có thể cho quầng sáng nhỏ hơn bình thường.

-Không tôn trọng khoảng cách giữa các đĩa khiến một vầng hào quang chồng lên nhau và chúng không thể đọc chính xác.

- Ủ bằng CO ₂ làm tăng kích thước quầng sáng của đĩa tetracyclin và methicillin.

-Nuôi ở nhiệt độ dưới 35 ° C tạo ra quầng sáng lớn hơn.

- Bổ sung máu làm giảm kích thước của quầng sulfa.

Giới hạn

Độ nhạy của một kháng sinh được chứng minh trong biểu đồ kháng sinh đối với vi sinh vật (in vitro) không phải là đảm bảo rằng nó sẽ hoạt động trong cơ thể sống.

QA

Để biết môi trường có chứa đủ lượng thymine hay không, phải cấy chủng Enterococcus faecalis ATCC 29212 và thử độ mẫn cảm với trimethoprim sulfamethoxazole (SXT), phải cho quầng bằng hoặc> 20 mm là đạt yêu cầu.

Người giới thiệu

1. "Thạch Müller-Hinton." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 16 tháng 11 năm 2018, 12:23 giờ UTC. 27 tháng 1, 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Điều kiện để nghiên cứu tính nhạy cảm tốt bằng thử nghiệm khuếch tán thạch. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Phòng thí nghiệm Difco Francisco Soria Melguizo. Thạch Müeller Hinton với 5% máu cừu. 2009 Có tại: http://f-soria.es
5. Phòng thí nghiệm thạch BD Müeller Hinton II. 2017. Có sẵn tại: .bd.com
6. Phòng thí nghiệm Britannia. Thạch Müeller Hinton. 2015. Có sẵn tại: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamase loại AmpC: Tổng quát và phương pháp phát hiện kiểu hình. Linh mục Soc. Ven. Vi sinh. Năm 2009; 29 (2): 78-83. Có tại: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Phát hiện kiểu hình của metallobetalactamases trong các phân lập lâm sàng của Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Có tại: scielo.org.