DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): ĐẶC ĐIỂM, CƠ SỞ LÝ LUẬN, SỬ DỤNG - HÓA HỌC - 2026

Các DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) là một loại thuốc nhuộm bởi sở hữu huỳnh quang đóng vai trò như một điểm đánh dấu, được sử dụng rộng rãi trong nghệ thuật kính hiển vi huỳnh quang hoặc đo dòng tế bào, trong số những người khác. Ánh sáng huỳnh quang mà nó phát ra có màu xanh lam sáng, kích thích của nó xảy ra trong khoảng 455-461 nm (ánh sáng UV).

Thuốc nhuộm DAPI có thể đi qua màng tế bào chết một cách dễ dàng. Nó cũng có thể nhuộm nhân tế bào sống, nhưng trong trường hợp này, nồng độ của chất này phải cao hơn.

Cấu trúc hóa học của thuốc nhuộm huỳnh quang DAPI. Nguồn: Hình ảnh: Tệp: DAPI.svg là phiên bản vectơ của tệp này. Nó nên được sử dụng thay cho hình ảnh raster này khi không kém hơn / Richard Wheeler (Zephyris) Hình ảnh đã chỉnh sửa

Thuốc nhuộm có khả năng truy cập vào DNA của tế bào mà nó có ái lực đặc biệt, liên kết với các gốc nitơ adenine và thymine. Vì lý do này, nó rất hữu ích trong một số kỹ thuật sinh học phân tử.

Hợp chất này thuộc nhóm thuốc nhuộm indole và đã được chứng minh là có độ nhạy cao hơn với DNA so với ethidium bromide và propidium iodide, đặc biệt là trên gel agarose.

Việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang này rất rộng rãi, vì nó rất hữu ích cho: nghiên cứu những thay đổi trong DNA trong quá trình apoptotic (chết tế bào) và do đó phát hiện các tế bào trong quá trình này; đối với ảnh in dấu chân DNA (DNA photo print); để nghiên cứu ô nhiễm vi khuẩn; hoặc để hình dung sự phân đoạn hạt nhân.

Nó cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu các dải nhiễm sắc thể, trong việc phát hiện Mycoplasmas sp DNA, trong tương tác DNA-protein, trong nhuộm và đếm tế bào bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang và thậm chí để tạo màu cho các hạt phấn trưởng thành.

nét đặc trưng

DAPI là tên viết tắt của tên hóa học của nó (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole). Công thức phân tử của nó là C ₁₆ H ₁₅ N _5. Nó có trọng lượng phân tử là 350,3. Ở gần dải ánh sáng UV (345 đến 358 nm), phức hợp DAPI-DNA xảy ra kích thích tối đa, trong khi phát xạ huỳnh quang cực đại xảy ra trong khoảng 455-461 nm.

Thuốc nhuộm này có đặc điểm là dạng bột màu vàng, nhưng các cấu trúc được đánh dấu bằng fluorophore này phát ra ánh sáng xanh lam rực rỡ.

Nó là một hợp chất hòa tan trong nước, tuy nhiên, để tăng tốc độ hòa tan của nó, một số nhiệt có thể được áp dụng. Nó có thể được pha loãng với PBS nhưng không được hòa tan trực tiếp trong đó.

Một khi thuốc nhuộm được chuẩn bị, nó phải được bảo quản trong bóng tối, nghĩa là tránh ánh sáng, ở nhiệt độ từ 2 đến 8 ° C (tủ lạnh). Trong những điều kiện này, thuốc nhuộm bền hơn 3 tuần hoặc vài tháng.

Nếu nó được bảo vệ khỏi ánh sáng nhưng để ở nhiệt độ phòng, độ ổn định của nó giảm xuống còn 2 hoặc 3 tuần, nhưng tiếp xúc với ánh sáng trực tiếp thì sự hư hỏng rất nhanh. Nếu bạn muốn lưu trữ lâu hơn, nó có thể được làm lạnh ở -20 ° C được phân phối trong các phần nhỏ.

Nền tảng

Quá trình nhuộm này dựa trên việc tạo ra một phản ứng hạt nhân trong các kỹ thuật sinh học phân tử chính, chẳng hạn như: đo tế bào dòng chảy, kính hiển vi huỳnh quang và nhuộm các nhiễm sắc thể chuyển dạng hoặc nhân giữa các pha, trong số những kỹ thuật khác.

Kỹ thuật này dựa trên ái lực lớn mà thuốc nhuộm có đối với các bazơ nitơ (adenin và thymine) có trong vật liệu di truyền (DNA) ở rãnh nhỏ. Trong khi ở cấp độ tế bào chất, nó để lại rất ít nền.

Khi chất nhuộm huỳnh quang liên kết với các vùng adenin và thymine của DNA, sự phát huỳnh quang tăng lên đáng kể (gấp 20 lần). Màu sắc nó phát ra là màu xanh sáng. Đáng chú ý, không có sự phát huỳnh quang khi liên kết với các cặp base GC (guanin-cytosine).

Điều quan trọng cần lưu ý là mặc dù nó cũng có ái lực với RNA nhưng nó không gây ra vấn đề gì, vì mức độ phát xạ năng lượng cao nhất từ ​​phân tử này xảy ra ở bước sóng khác (500 nm), không giống như DNA, ở bước sóng 460 nm. Hơn nữa, sự gia tăng huỳnh quang sau khi liên kết với RNA chỉ là 20%.

DAPI được sử dụng nhiều hơn để nhuộm các tế bào chết (cố định) so với tế bào sống, vì cần nồng độ thuốc nhuộm cao hơn nhiều để nhuộm màu sau, điều này là do màng tế bào ít thấm DAPI hơn khi nó còn sống.

Thuốc nhuộm DAPI có thể được sử dụng kết hợp với fluorophores màu đỏ và xanh lá cây để có trải nghiệm đa màu sắc.

Sử dụng

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) là một fluorophore tuyệt vời và do đó được sử dụng rộng rãi trong các kỹ thuật khác nhau và cho các mục đích khác nhau. Phần sau giải thích việc sử dụng DAPI trong các kỹ thuật chính.

Đo tế bào dòng chảy

Các nhà nghiên cứu Gohde, Schumann và Zante vào năm 1978 là những người đầu tiên sử dụng và đề xuất DAPI như một fluorophore trong kỹ thuật đo tế bào dòng chảy, đã đạt được thành công lớn do độ nhạy cao đối với DNA và cường độ phát xạ huỳnh quang cao của nó.

Việc sử dụng DAPI trong kỹ thuật này cho phép nghiên cứu chu kỳ tế bào, định lượng tế bào và nhuộm tế bào sống và chết.

Mặc dù có các chất tạo màu khác, chẳng hạn như ethidium bromide, Hoechst oxide, acridine cam và propidium iodide, DAPI là một trong những chất được sử dụng rộng rãi nhất vì nó dễ quang hơn những chất đã đề cập trước đây.

Đối với kỹ thuật này, cần phải cố định các tế bào, đối với điều này, có thể sử dụng ethanol tuyệt đối hoặc 4% paraformaldehyde. Mẫu được ly tâm và phần nổi phía trên được loại bỏ, sau đó các tế bào được hydrat hóa bằng cách thêm 5 ml đệm PBS trong 15 phút.

Trong khi thời gian trôi qua, chuẩn bị vết DAPI bằng dung dịch đệm nhuộm (FOXP3 từ BioLegend) ở nồng độ 3 µM.

Ly tâm mẫu, loại bỏ phần nổi phía trên, sau đó phủ 1 ml dung dịch DAPI trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

Đưa mẫu đến máy đo lưu lượng tế bào với tia laser thích hợp.

Phép đo siêu nhỏ dòng chảy

Một kỹ thuật khác trong đó DAPI được sử dụng là đo vi lưu huỳnh cùng với một fluorophore khác gọi là mithramycin. Cả hai đều hữu ích để định lượng DNA lục lạp riêng lẻ, nhưng DAPI phù hợp nhất để đo các hạt thực khuẩn T4.

Lai ghép

Kỹ thuật này về cơ bản sử dụng các đầu dò DNA được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang có thể là DAPI.

Mẫu yêu cầu xử lý nhiệt để làm biến tính DNA sợi đôi và chuyển nó thành hai sợi đơn. Sau đó, nó được lai với một mẫu dò DNA biến tính đánh dấu DAPI có một trình tự quan tâm.

Sau đó, nó được rửa để loại bỏ những gì không được lai, một chất tương phản được sử dụng để hình dung DNA. Kính hiển vi huỳnh quang cho phép quan sát đầu dò lai ghép.

Kỹ thuật này có mục đích phát hiện các trình tự cụ thể trong DNA nhiễm sắc thể, có thể chẩn đoán một số bệnh.

Các kỹ thuật phân tử tế bào này đã giúp ích rất nhiều trong việc xác định các chi tiết trong nghiên cứu các karyotype. Ví dụ, ông đã chỉ ra các vùng giàu cặp bazơ của adenosine và thymine được gọi là vùng dị sắc hoặc dải DAPI.

Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu nhiễm sắc thể và chất nhiễm sắc ở thực vật và động vật, cũng như trong chẩn đoán bệnh lý trước sinh và huyết học ở người.

Trong kỹ thuật này, nồng độ DAPI được khuyến nghị là 150 ng / ml trong thời gian 15 phút.

Các slide đã lắp ráp nên được bảo quản tránh ánh sáng ở 2-8 ° C.

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang

Tế bào được cố định bằng 4% paraformaldehyde. Nếu các vết bẩn khác được sử dụng, DAPI được để lại ở cuối như một chất chống lại và các tế bào được bao phủ bằng dung dịch PBS trong 15 phút. Trong khi thời gian trôi qua, chuẩn bị dung dịch DAPI bằng cách pha loãng với PBS, sao cho nồng độ cuối cùng là 300 µM.

Sau đó, PBS thừa được loại bỏ và phủ DAPI trong 5 phút. Rửa nhiều lần. Slide được xem dưới kính hiển vi huỳnh quang dưới bộ lọc thích hợp.

Tấm an toàn

Hợp chất này phải được xử lý cẩn thận, vì nó là một hợp chất có đặc tính gây đột biến. Than hoạt tính được sử dụng để loại bỏ hợp chất này khỏi các dung dịch nước sẽ được loại bỏ.

Phải sử dụng găng tay, áo choàng và kính bảo hộ để tránh tai nạn với thuốc thử này. Nếu tiếp xúc với da hoặc niêm mạc, khu vực này cần được rửa sạch bằng đủ nước.

Bạn không bao giờ được pipet thuốc thử này bằng miệng, hãy sử dụng pipet.

Không làm nhiễm bẩn thuốc thử với các tác nhân vi sinh vật vì điều này sẽ dẫn đến kết quả sai.

Không pha loãng vết DAPI nhiều hơn mức khuyến cáo, vì nó sẽ làm giảm đáng kể chất lượng của vết bẩn.

Không để thuốc thử tiếp xúc với ánh sáng trực tiếp hoặc giữ ấm vì điều này làm giảm huỳnh quang.

Người giới thiệu

1. Brammer S, Toniazzo C và Poersch L. Corantes thường tham gia vào quá trình di truyền tế bào thực vật. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Có sẵn từ: scielo.
2. Phòng thí nghiệm Impath. DAPI. Có sẵn tại: menarinidiagnostics.com/
3. Phòng thí nghiệm Cytocell. 2019. Hướng dẫn sử dụng DAPI. có tại cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Các khái niệm và kỹ thuật trong sinh thái sông. (2009). Biên tập Rubes, Tây Ban Nha. Có tại: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Sử dụng huỳnh quang trong phương pháp máy tách đã sửa đổi để ước tính số lượng tế bào cơ trong mô tim. Vòm. Áo ngực. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Có sẵn từ: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Sự hiện diện của phytoplasmas trong đu đủ (Carica đu đủ) ở Mexico. Tạp chí Chapingo. Loạt phim về nghề làm vườn, 2011; 17 (1), 47-50. Có tại: scielo.org.