THỬ NGHIỆM CATALASE: CƠ SỞ LÝ LUẬN, KỸ THUẬT VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2026

Các thử nghiệm catalase là một phương pháp được sử dụng trong các phòng thí nghiệm vi khuẩn học tiết lộ sự hiện diện của các enzyme catalase trong những vi khuẩn sở hữu nó. Cùng với nhuộm Gram, chúng là các xét nghiệm chính cần được thực hiện trên các vi sinh vật mới phân lập. Các thử nghiệm này hướng dẫn nhà vi sinh vật học về các bước cần tuân theo để xác định chính xác vi sinh vật được đề cập.

Nói chung, vi khuẩn có chứa cytochrome sở hữu enzyme catalase, có nghĩa là vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí dễ sinh sản nên sở hữu nó. Tuy nhiên, vẫn có những trường hợp ngoại lệ, chẳng hạn như Streptococcus, mặc dù là vi sinh vật kỵ khí dễ nuôi, không sở hữu enzyme catalase.

Chạy Thử nghiệm Catalase, cho thấy một phản ứng dương tính. Nguồn: Không cung cấp tác giả có thể đọc bằng máy. Nase giả định (dựa trên yêu cầu bản quyền).

Đây là lý do tại sao xét nghiệm catalase được sử dụng chủ yếu để phân biệt họ Staphylococaceae và Micrococaceae (cả hai đều catalase dương tính) với họ Streptococaceae (catalase âm tính).

Tương tự như vậy, chi Bacillus (catalase dương tính) được phân biệt với chi Clostridium (catalase âm tính), trong số những chi khác.

Nền tảng

Catalase là một enzym được phân loại là hydroperoxidase, điều này có nghĩa là chúng sử dụng hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) làm chất nền .

Nó cũng được coi là một oxidoreductase, vì trong phản ứng mà nó tham gia có một phần tử đóng vai trò là chất cho điện tử (chất khử) và một phần tử khác đóng vai trò là chất nhận điện tử (chất oxy hóa).

Catalase là một protein có chứa một nhóm proseric với bốn nguyên tử sắt hóa trị ba (Fe ⁺⁺⁺ ), do đó nó là một homoprotein. Ion sắt vẫn bị oxy hóa trong quá trình phản ứng.

Có thể nói catalase là một enzym khử độc, vì chức năng của nó là khử các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn gây độc cho vi khuẩn. Trong số các chất này có hydrogen peroxide.

Hydrogen peroxide được hình thành từ sự phân hủy của đường trong cơ thể. Quá trình này xảy ra như sau:

Ion superoxide (O ₂ ^- ) (gốc tự do) được hình thành là sản phẩm cuối cùng của quá trình đồng hóa glucose bằng con đường hiếu khí. Đây là chất độc và được loại bỏ bởi enzyme superoxide dismutase, biến nó thành oxy dạng khí và hydro peroxit.

Hydrogen peroxide cũng độc đối với vi khuẩn và phải được loại bỏ. Enzyme catalase phân hủy hydrogen peroxide thành nước và oxy.

Catalase có thể tác dụng với các chất nền không phải là hydrogen peroxide, chẳng hạn như rượu, andehit, axit, amin thơm và phenol. Tuy nhiên, hydro peroxit cũng có thể được catalase sử dụng để oxy hóa các hợp chất độc hại khác như metyl và rượu etylic.

Tương tự như vậy, catalase có trong các tế bào thực bào, bảo vệ nó khỏi tác động độc hại của hydrogen peroxide.

Kỹ thuật định kỳ để kiểm tra Catalase

-Phương pháp trượt

nguyên vật liệu

3% hydrogen peroxide (10 thể tích).

Kính hiển vi

Cán nhựa dùng một lần hoặc tăm gỗ.

Quá trình

Lấy đủ khuẩn lạc để nghiên cứu mà không cần chạm vào thạch mà nó đến. Khuẩn lạc phải còn tươi, nghĩa là từ môi trường nuôi cấy từ 18 đến 24 giờ.

Đặt khuẩn lạc lên phiến kính khô và thêm một giọt hydro peroxit 3% (cũng có thể sử dụng 30% H ₂ O ₂ ). Quan sát ngay xem có bọt khí thoát ra hay không.

Diễn dịch

Phản ứng thuận: sự tiến hóa của chất khí, bằng chứng là sự tạo thành bọt khí (sủi bọt mạnh).

Phản ứng âm tính: không tạo bọt.

-Phương pháp trực tiếp trong nuôi cấy thuần

Cho 1 ml H ₂ O ₂ 3% lên đĩa tinh khiết hoặc mẫu cấy không chứa máu (tốt nhất là thạch dinh dưỡng). Quan sát ngay xem có bong bóng hình thành hay không. 30% H ₂ O ₂ cũng có thể được sử dụng .

Nó được diễn giải giống như phương thức đối tượng porta.

-Method với ống mao dẫn hoặc Fung và Petrishko

Đổ đầy ống mao dẫn 67 mm đến chiều cao 20 mm bằng 3% hydro peroxit theo độ mao dẫn.

Chạm vào khuẩn lạc đã phân lập được để nghiên cứu với ống mao dẫn chứa đầy 3% H ₂ O _{2 .} Quan sát xem ống mao dẫn có đầy bọt khí trong khoảng 10 giây hay không. Phương pháp này cho phép bán định lượng phản ứng trong các phép lai:

Không có chữ thập không có bong bóng (phản ứng âm tính)

+ ---- Ít bọt (phản ứng yếu hoặc chậm).

++ --– Bọt khí nhiều (phản ứng vừa phải).

+++ --Buổi đạt kết thúc ngược lại (phản ứng mạnh).

-Taylor và Achanzar phương pháp cho các bài kiểm tra catalase có nghi vấn

Đặt khuẩn lạc đã phân lập trên phiến kính khô và sạch, sau đó nhỏ một giọt H ₂ O ₂ 0,5% và đậy bằng kẹp bìa. Quan sát xem có sự hình thành các bong bóng bị mắc kẹt hay không.

Giải thích: sự hiện diện của bọt khí chứng tỏ phản ứng dương tính. Không có bong bóng, nó được hiểu là một phản ứng tiêu cực.

Thử nghiệm catalase cho các loài Mycobacterium

Kỹ thuật này cần được thực hiện bằng cách kiểm soát độ pH và nhiệt độ. Nó phải được thực hiện trong một tủ hút tầng, vì việc thao tác với các loài Mycobacterium khác nhau là nguy hiểm.

-Nguyên vật liệu

Hydrogen peroxide 30% hoặc 110 thể tích (superoxal).

Dung dịch đệm photphat pH 7

10% Giữa 80

Nuôi cấy Mycobacterium nêm trong 3 đến 4 tuần

-Sự chuẩn bị

Dung dịch đệm photphat pH 7

Cân:

1.361 g kali photphat khan (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g dinatri khan (Na2HPO3) photphat.

Hòa tan cả hai muối trong một ít nước cất vô trùng và thêm nước đến 1000 ml.

10% Giữa 80

Pha loãng 1:10 thành Tween 80 được cô đặc thương mại, để thực hiện việc này như sau:

Lấy 1 ml Tween 80 cho vào một ít nước cất, hòa tan rồi thêm nước đến vạch mức 10 ml.

Thuốc thử cuối cùng

Trộn một lượng đệm phosphat với lượng 10% Tween 80 (các phần bằng nhau). Xác định số lượng bạn muốn chuẩn bị trong phòng thí nghiệm.

-Quá trình

Cho 5 ml đệm phosphat vào ống nghiệm vô trùng có nắp vặn (Bakelite).

Với một vòng lặp cấy, lấy đủ khuẩn lạc của vi khuẩn Mycobacterium được gieo vào các hạt nêm và hòa tan trong dung dịch đệm photphat.

Đậy ống mà không siết quá chặt chỉ. Đặt trong nồi cách thủy ở 68 ° C trong 20 đến 30 phút. Lấy ra và để nguội đến 22-25 ° C

Đong 0,5 ml thuốc thử cuối cùng (đã trộn) và thêm dung dịch lạnh vào ống. Quan sát sự hình thành hay không của bong bóng.

Nó được giải thích giống như các kỹ thuật trước đó.

Sử dụng

Khi thu được sự phát triển của khuẩn lạc trong môi trường được làm giàu, cần thực hiện nhuộm Gram và thử catalase trên các khuẩn lạc thu được. Điều này sẽ hướng dẫn nhà vi sinh học về các quy trình cần tuân theo để xác định chính xác.

Nguồn: Biên soạn bởi tác giả ThS. Marielsa gil

QA

Để đánh giá tính năng tốt của thuốc thử hydrogen peroxide, hãy sử dụng các chủng đối chứng mới nuôi cấy, chẳng hạn như Staphylococcus aureus làm đối chứng dương tính và chủng Streptococcus sp làm đối chứng âm tính.

Một phương pháp thay thế khác được coi là đối chứng dương tính là nhỏ một giọt hydrogen peroxide lên thạch máu, hồng cầu có catalase, do đó, sẽ có sủi bọt nếu thuốc thử ở trong tình trạng tốt.

Có thể dùng thạch sô cô la làm đối chứng âm tính, ở đây hồng cầu đã được ly giải và xét nghiệm âm tính.

Hạn chế

-Không sử dụng các mẫu cấy cũ cho bài kiểm tra, vì điều này có thể gây ra âm tính giả.

-Tránh lấy khuẩn lạc từ dịch cấy trên thạch máu, nếu không cẩn thận chạm vào thạch; Quy trình này có thể dẫn đến dương tính giả, vì tế bào hồng cầu chứa catalase.

-Nếu bạn lấy khuẩn lạc bằng tay cầm bạch kim, không đảo ngược trình tự của quy trình vì điều này có thể tạo ra dương tính giả. Điều này là do bạch kim có thể phản ứng với hydrogen peroxide, gây ra sủi bọt.

-Không sử dụng thuốc thử hydrogen peroxide nếu thuốc thử đã quá cũ, vì thuốc thử rất không ổn định và có xu hướng phân hủy theo thời gian.

- Giữ thuốc thử hydrogen peroxide tránh ánh sáng và để trong tủ lạnh để tránh hư hỏng.

-Thực hiện kiểm tra chất lượng thuốc thử hydrogen peroxide mỗi khi sử dụng.

- Hãy lưu ý rằng nếu sử dụng 30% H ₂ O ₂ thì phản ứng xảy ra mạnh hơn phản ứng xảy ra với 3% H ₂ O ₂ .

Người giới thiệu

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Các xét nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn có tầm quan trọng lâm sàng. Ấn bản thứ 3. Biên tập Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Phòng thí nghiệm BD. Thuốc thử Catalase-Gotario. Có tại: http://winklerltda.cl
5. Phòng thí nghiệm Vadequímica. Peroxit. Sự tương đương giữa khối lượng và tỷ lệ phần trăm. Có tại: vadequimica.com