NHUỘM BÀO TỬ: CƠ SỞ LÝ LUẬN, KỸ THUẬT VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2026

Các nhuộm bào tử là phương pháp luận sử dụng để tô màu các cấu trúc kháng mà hình thành một số chi vi khuẩn khi trong điều kiện không thuận lợi; Những cấu trúc này tương ứng với một hình thức sinh tồn.

Có nhiều chi hình thành bào tử; tuy nhiên, những loài chính là Bacillus và Clostridium. Các chi này được coi là có liên quan hơn vì chúng có các loài gây bệnh cho người.

Nhuộm bào tử bằng phương pháp Shaeffer - Fulton hoặc Wirtz-Conklin. Và tambe (người tải lên gốc), từ Wikimedia Commons

Mỗi trực khuẩn có thể phát sinh một bào tử. Tại thời điểm nhuộm chế phẩm, bào tử có thể được tìm thấy bên trong trực khuẩn (endospore) hoặc bên ngoài nó (exospore). Với kỹ thuật nhuộm vi khuẩn thông thường - chẳng hạn như nhuộm Gram - các bào tử vẫn không màu.

Hiện nay, có một số phương pháp nhuộm có khả năng xuyên qua cấu trúc dày của bào tử để nhuộm nó. Các phương pháp này rất đa dạng; Chúng bao gồm kỹ thuật Dorner, vết Möeller và phương pháp Shaeffer - Fulton, còn được gọi là Wirtz-Conklin.

Trong tất cả các kỹ thuật được đề cập, phương pháp Shaeffer-Fulton được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí nghiệm thông thường. Nó được đặt theo tên của hai nhà vi sinh vật học đã tạo ra màu vào năm 1930: Alicia Shaeffer và MacDonald Fulton. Tuy nhiên, kỹ thuật này đôi khi được đặt tên là Wirtz-Conklin theo tên của hai nhà vi khuẩn học từ những năm 1900.

Nền tảng

Các bào tử không bị ố vàng với các vết bẩn thông thường vì chúng có thành rất dày. Thành phần phức tạp của bào tử ngăn cản sự xâm nhập của hầu hết các chất màu.

Nếu nghiên cứu bào tử từ ngoài vào trong, người ta quan sát thấy các lớp sau: thứ nhất, có lớp ngoài, là lớp mỏng nhất và bên ngoài được tạo thành bởi glycoprotein.

Tiếp theo là lớp biểu bì, có khả năng chống lại nhiệt độ cao, tiếp theo là lớp vỏ được cấu tạo bởi peptidoglycan. Sau đó là bức tường của đế bảo vệ protoplast.

Bào tử là một cấu trúc khử nước có chứa 15% canxi và axit ađipicolinic. Do đó, hầu hết các kỹ thuật nhuộm bào tử dựa vào việc áp dụng nhiệt để thuốc nhuộm có thể thâm nhập vào cấu trúc dày.

Một khi bào tử bị nhuộm, nó không thể loại bỏ thuốc nhuộm. Trong kỹ thuật Shaeffer - Fulton, malachite green xâm nhập vào tế bào sinh dưỡng và khi được tác động nhiệt, nó sẽ xâm nhập vào nội bào tử cũng như ngoại bào tử.

Bằng cách rửa bằng nước, thuốc nhuộm được loại bỏ khỏi tế bào sinh dưỡng. Điều này xảy ra do thuốc nhuộm xanh malachit có tính bazơ nhẹ, vì vậy nó liên kết yếu với tế bào sinh dưỡng.

Thay vào đó, nó không thể thoát ra khỏi bào tử và cuối cùng trực khuẩn bị nhiễm safranin. Nền tảng này có giá trị đối với phần còn lại của các kỹ thuật, trong đó điều gì đó tương tự cũng xảy ra.

Kỹ thuật nhuộm bào tử

Để thực hiện nhuộm bào tử, phải thu được mẫu cấy thuần chủng của chủng nghi ngờ cần nghiên cứu.

Môi trường nuôi cấy phải chịu nhiệt độ khắc nghiệt trong 24 giờ để kích thích vi sinh vật sinh bào tử. Đối với điều này, mẫu cấy có thể được đặt trong tủ sấy ở 44 ° C hoặc trong tủ lạnh (8 ° C) trong 24 hoặc 48 giờ.

Nếu để quá lâu ở nhiệt độ đã đề cập, sẽ chỉ quan sát được ngoại bào tử, vì tất cả nội bào tử đã thoát ra khỏi trực khuẩn.

Hết thời gian, nhỏ vài giọt dung dịch sinh lý vô trùng lên phiến kính sạch. Sau đó, một phần nhỏ của nền văn hóa được lấy và tạo ra một lớp nhỏ.

Sau đó, nó được để khô, cố định trong nhiệt và nhuộm bằng một trong các kỹ thuật được giải thích dưới đây:

Kỹ thuật Dorner

1- Chuẩn bị trong ống nghiệm một huyền phù đậm đặc của vi sinh vật đã sinh sôi trong nước cất và thêm một lượng tương đương Kinyoun carbol fuchsin đã lọc.

2- Đặt ống trong bồn nước sôi từ 5 đến 10 phút.

3- Trên phiến kính sạch, trộn một giọt huyền phù trước với một giọt dung dịch nước nigrosin 10%, đun sôi và lọc.

4- Trải và làm khô nhanh chóng bằng nhiệt nhẹ nhàng.

5- Kiểm tra bằng vật kính 100X (ngâm nước).

Bào tử nhuộm màu đỏ và tế bào vi khuẩn gần như không màu trên nền xám đen.

Kỹ thuật Dorner sửa đổi

1- Huyền phù của vi sinh vật hình thành được trải trên một phiến kính và cố định trong nhiệt.

2- Mẫu được bao phủ bởi một dải giấy lọc được thêm carbol fuchsin. Chất màu được đun nóng từ 5 đến 7 phút bằng ngọn lửa của đèn Bunsen cho đến khi tạo ra hơi nước. Sau đó, giấy được lấy ra.

3- Chế phẩm rửa sạch bằng nước sau đó dùng giấy thấm khô.

4- Che vết phết bằng một màng mỏng nigrosin 10%, dùng lam thứ hai để phết nigrosin hoặc kim.

Màu sắc do bào tử và vi khuẩn thực hiện giống như màu được mô tả trong phần trước.

Shaeffer - Kỹ thuật Fulton hoặc Wirtz-Conklin

1- Tạo vết bẩn mịn bằng huyền phù của vi sinh vật đã bào chế trên phiến kính và cố định ở nhiệt độ cao.

2- Phủ lên phiến kính bằng dung dịch nước xanh malachit 5% (có thể đặt giấy lọc lên phiến kính).

3- Đun nóng trên ngọn lửa của đầu đốt Bunsen để giải phóng hơi và loại bỏ ngọn lửa. Lặp lại thao tác trong 6 đến 10 phút. Nếu dung dịch xanh malachit bay hơi quá nhiều trong quá trình này, có thể thêm nhiều hơn.

4- Tháo giấy lọc (nếu đã lắp) và rửa bằng nước.

5- Phủ lên phiến kính với 0,5% safranin trong 30 giây (một số biến thể của kỹ thuật sử dụng 0,1% safranin trong nước và để trong 3 phút).

Với kỹ thuật này, bào tử có màu xanh lục và trực khuẩn có màu đỏ.

Có nhược điểm là nội bào tử của các mẫu cấy non không bắt màu tốt, vì chúng có vẻ cực kỳ trong hoặc không màu. Để tránh điều này, nên sử dụng các mẫu cấy 48 giờ ủ.

Kỹ thuật Möeller

1- Che vết bẩn bằng cloroform trong 2 phút.

2- Loại bỏ cloroform.

3- Đậy bằng axit cromic 5% trong 5 phút.

4- Rửa bằng nước cất

5- Tấm được phủ bằng carbol fuchsin-fenicada và được tiếp xúc với ngọn lửa của đầu đốt Bunsen cho đến khi phát ra hơi; sau đó nó được đưa ra khỏi ngọn lửa trong một thời gian ngắn. Thao tác được lặp lại cho đến khi hoàn thành 10 phút.

6- Rửa sạch bằng nước.

7- Dùng etanol đã axit hoá (rượu clohiđric) để làm mất màu. Nó được để trong 20 hoặc 30 giây.

8- Rửa bằng nước cất.

9- Tẩy bằng cách phủ lên tấm bằng xanh methylen trong 5 phút.

10- Rửa bằng nước cất.

11- Để khô và mẫu được đưa lên kính hiển vi.

Bào tử có màu đỏ và trực khuẩn màu xanh lam. Điều quan trọng là không hít phải hơi nước, vì chúng rất độc và về lâu dài có thể gây ung thư.

Kỹ thuật Möeller được sửa đổi mà không cần nhiệt

Năm 2007 Hayama và các cộng sự của ông đã tạo ra một bản sửa đổi của kỹ thuật Möeller. Họ đã loại bỏ bước đun nóng thuốc nhuộm và thay thế bằng cách thêm 2 giọt chất hoạt động bề mặt Tergitol 7 cho mỗi 10 ml dung dịch carbol fuchsin-carbol. Kết quả tương tự cũng thu được.

Các ứng dụng

Màu sắc của bào tử cung cấp thông tin rất có giá trị và hữu ích cho việc xác định mầm bệnh, vì sự hiện diện của nó, hình dạng, vị trí bên trong trực khuẩn và khả năng biến dạng tế bào sinh dưỡng hay không, là những dữ liệu có thể định hướng cho loài tham gia vào một thể loại nhất định.

Trong bối cảnh này, điều đáng nói là các bào tử có thể hình tròn hoặc hình bầu dục, chúng có thể nằm ở trung tâm hoặc cũng có thể ở vị trí song tâm, phụ hoặc cuối.

Sơ đồ về hình dạng và vị trí của nội bào tử và ngoại bào tử.

Ví dụ

- Clostridium difficile tạo thành bào tử hình bầu dục ở vị trí tận cùng làm biến dạng trực khuẩn.

- Bào tử của Clostridium tertium hình bầu dục, không làm biến dạng trực khuẩn và nằm ở tầng tận cùng.

- Nội bào tử của Clostridium tetani là đầu cuối và làm biến dạng trực khuẩn, cho hình dạng giống dùi trống.

- Bào tử của vi khuẩn Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy và C.nticum có hình bầu dục tròn hoặc hình bầu dục dưới tinh và làm biến dạng trực khuẩn.

- Nội bào tử của Clostridium sordelli nằm ở vị trí trung tâm, biến dạng nhẹ.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Xuất bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana SA

Người giới thiệu

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Đề xuất một kỹ thuật đơn giản để nhuộm bào tử vi khuẩn mà không cần áp dụng nhiệt - đã sửa đổi thành công phương pháp của Moeller. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Những người đóng góp Wikipedia. Vết bẩn Moeller. Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 3 tháng 11 năm 2018, 03:28 UTC. Có tại: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Tài liệu hướng dẫn sử dụng kỹ thuật vi sinh trong phòng thí nghiệm. Khoa Khoa học Cơ bản Học viện Vi sinh vật học. Viện bách khoa quốc gia.
4. "Nội bào tử." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 25 tháng 2 năm 2018, 10:20 giờ UTC. 10 tháng 1 năm 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J và các cộng tác viên. (2006). Nhân viên lao động của cộng đồng tự trị Extremadura. Chương trình cụ thể Tập IV. Biên tập MAD. Seville-Tây Ban Nha, trang 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm chuyên khoa, Dịch vụ Y tế Galicia (SERGAS). Chương trình nghị sự môn học cụ thể tập 2. MAD biên tập. Seville-Tây Ban Nha, trang 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Xuất bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Biên tập Panamericana SA