PHẾT TẾ BÀO VI KHUẨN: ĐẶC ĐIỂM VÀ CÁCH CHUẨN BỊ - SINH HỌC - 2025

Các bôi nhọ vi khuẩn là một màng mỏng bôi nhọ của một hệ thống treo của các vi sinh vật vi khuẩn đó được thực hiện trên một tấm kính trong suốt hoặc trượt, để quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng.

Việc kéo dài dưới dạng màng được thực hiện để tách các vi sinh vật càng nhiều càng tốt, vì nếu chúng được nhóm lại thì việc quan sát sẽ không rõ ràng.

Hình 1. Vết bẩn vi khuẩn nhìn thấy dưới kính hiển vi điện tử quét. Nguồn: pixbay.com

Trong nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn, các kỹ thuật chuẩn bị, cố định và nhuộm phết tế bào được sử dụng để phân tích chúng tốt hơn. Do kích thước nhỏ của vi sinh vật, việc sử dụng kính hiển vi quang học là cần thiết để quan sát chúng.

Kính hiển vi quang học là dụng cụ cần thiết để quan sát vết bẩn. Chúng sử dụng thấu kính quang học và ánh sáng cho phép xem các mẫu với độ phóng đại cao.

Nhìn chung, tế bào sống không có cấu trúc chủ yếu là màu, nhìn bằng kính hiển vi ánh sáng, chúng là những mẫu không màu, trong suốt và chúng thể hiện rất ít độ tương phản bên trong và với môi trường của chúng.

Việc quan sát bằng kính hiển vi quang học trường sáng đơn giản, không sử dụng các kỹ thuật nhuộm phụ trợ, rất hạn chế và chỉ được sử dụng trong một số trường hợp, chẳng hạn như trong quan sát chuyển động của vi sinh vật.

Để quan sát tối ưu các vi sinh vật, phải cân bằng giữa độ tương phản và độ phân giải. Các chi tiết tế bào không thể nhìn thấy dưới kính hiển vi, ngay cả với độ phân giải cao; Việc sử dụng thuốc nhuộm được yêu cầu thông qua các kỹ thuật nhuộm, tạo độ tương phản để quan sát.

Đặc điểm của phết tế bào vi khuẩn chất lượng tốt

Độ tương phản tuyệt vời

Để đạt được độ tương phản tuyệt vời, có những kính hiển vi tinh vi được gọi là kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi giao thoa vi sai và kính hiển vi trường tối. Loại kính hiển vi này được sử dụng để quan sát các cấu trúc của vi khuẩn như vỏ bọc và sợi tơ, trong số những loại khác.

Nhuộm màu là một kỹ thuật đơn giản để tăng độ tương phản đạt được bằng kính hiển vi trường sáng. Trong kỹ thuật này, các vết bẩn khác nhau có thể được sử dụng, giúp cải thiện đáng kể khả năng quan sát bằng kính hiển vi.

Các vết bẩn được thực hiện trực tiếp trên vết bẩn hoặc phần mở rộng của huyền phù vi sinh vật trên các phiến kính, đã được làm khô và cố định trước đó.

Sửa tốt

Cố định là một kỹ thuật được sử dụng để bảo tồn cấu trúc tế bào; gây bất hoạt vi sinh vật và bám dính vào kính của lam kính. Có các phương pháp điều trị cố định khác nhau: cố định nhiệt và cố định hóa học.

Cố định nhiệt

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để quan sát vết bẩn vi khuẩn. Kỹ thuật này bao gồm truyền huyền phù vi khuẩn của vết bôi qua ngọn lửa của một chiếc bật lửa. Kỹ thuật này có thể bảo tồn hình thái bên ngoài của vi khuẩn, nhưng phá hủy cấu trúc bên trong của chúng.

Cố định hóa học

Cố định hóa học sử dụng các hóa chất bảo quản, chẳng hạn như formaldehyde hoặc formalin, etanol và axit axetic, trong số những hóa chất khác. Ưu điểm của việc sử dụng các chất cố định hóa học là bảo tồn được các cấu trúc tế bào bên trong của vi sinh vật.

Hình 2. phết máu. Nguồn: Bobjgalindo, từ Wikimedia Commons

Nhuộm tốt

Các quy trình phổ biến nhất để nhuộm vết bẩn đã được làm khô và cố định trước đó là nhuộm dương tính hoặc đơn giản, nhuộm phân biệt và nhuộm âm tính. Ngoài ra còn có các kỹ thuật đặc biệt để nhuộm các cấu trúc tế bào cụ thể (nang, bào tử, roi).

Nhuộm tích cực hoặc nhuộm đơn giản

Nhuộm dương tính hoặc đơn giản là kỹ thuật nhuộm phết tế bào được sử dụng rộng rãi nhất. Nó sử dụng thuốc nhuộm có khả năng liên kết với các cấu trúc vi sinh vật nhất định, cho phép quan sát chúng dưới kính hiển vi.

Những thuốc nhuộm này có các nhóm mang màu (phần màu) trong cấu trúc hóa học của chúng, với các liên kết đôi xen kẽ và liên kết đơn (liên hợp). Những liên kết này lần lượt có thể thiết lập liên kết ion hoặc liên kết cộng hóa trị với một số cấu trúc tế bào.

Thuốc nhuộm dùng trong nhuộm dương tính hoặc nhuộm đơn giản hầu hết là dẫn xuất hóa học của anilin (muối hữu cơ tạo màu).

Mặt khác, trong số các loại thuốc nhuộm, chúng ta có thể tìm thấy một số loại có độ pH cơ bản và một số loại khác có độ pH axit.

Chất tạo màu cơ bản

Trong thuốc nhuộm cơ bản, nhóm mang màu có điện tích dương. Phần lớn các vi sinh vật nhân sơ có pH bên trong trung tính và bề mặt tế bào của chúng mang điện tích âm. Thông qua tương tác tĩnh điện này, chất mang màu liên kết với tế bào và nhuộm màu nó.

Ví dụ về thuốc nhuộm cơ bản là xanh methylen, tím pha lê, xanh malachit, fuscin cơ bản, safranin, trong số những loại khác.

Thuốc nhuộm axit

Trong thuốc nhuộm axit, nhóm mang màu có điện tích âm. Chúng được sử dụng để nhuộm protein với các nhóm amin tích điện dương. Ví dụ về thuốc nhuộm axit là axit fuscin, hồng Bengal, đỏ Congo và eosin.

Nhuộm màu khác biệt

Kỹ thuật nhuộm vi phân bao gồm áp dụng hai loại thuốc nhuộm có màu sắc hoặc cường độ khác nhau, để phân biệt các vi sinh vật khác nhau dưới kính hiển vi. Nhuộm Gram và vết kháng axit-cồn là những vết bẩn phân biệt được sử dụng phổ biến nhất trong vi khuẩn học.

Nhuộm Gram được sử dụng như một thử nghiệm sơ bộ để biết hình dạng, kích thước, phân nhóm tế bào, cũng như loại thành tế bào. Sử dụng xét nghiệm nhuộm Gram, vi khuẩn thành tế bào được phân loại thành vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.

Nhuộm âm tính

Trong kỹ thuật này, chất màu hóa học được sử dụng không xâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng làm cho môi trường chứa vi sinh vật xuất hiện dưới dạng nền đen.

Trong kỹ thuật nhuộm âm bản, vết bẩn được làm từ một giọt mực India hoặc huyền phù nigrosin, sau khi để khô ở nhiệt độ phòng sẽ tạo thành một màng mờ đục để ánh sáng truyền qua. Bằng cách này, vi sinh vật xuất hiện dưới dạng hình sáng trên nền tối.

Sự chuẩn bị

A. Smear

1.- Rửa các slide thật kỹ, lau khô bằng giấy thấm và dán nhãn. Nhãn phải ghi rõ nội dung của chế phẩm, ngày tháng và tên người chế biến.

2.- Bật lửa nhỏ và khử trùng vòng cấy trong ngọn lửa cho đến khi có màu đỏ tươi.

3.- Để tay cầm nguội.

4.- Lấy ống cấy vi khuẩn, tháo nắp và đưa nhanh miệng ống vào gần ngọn lửa đốt (ngọn lửa).

5.- Đưa vòng cấy vào ống chứa vi khuẩn nuôi cấy và lấy mẫu.

6.- Nếu mẫu cấy trong môi trường lỏng, đặt mẫu đã lấy bằng tay cầm vào giữa phiến kính và trải mẫu cẩn thận theo hình tròn có đường kính khoảng 2 cm.

7.- Khử trùng lại vòng cấy.

8.- Để vết bẩn khô trong không khí.

9. Lặp lại các bước từ 3 đến 8 ba lần.

10.- Nếu nuôi cấy trong môi trường đặc, trước đó phải nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính. Điều này được thực hiện để trộn một lượng nhỏ mẫu nuôi cấy được lấy với vòng cấy, theo chỉ dẫn trong bước 2 đến bước 5 (điều kiện vô trùng).

11. Rải mẫu đã pha loãng với giọt nước lên phiến kính và lặp lại ba lần.

B. Sự cố định

1. - Thêm hai giọt metanol hoặc etanol tuyệt đối vào các vết bẩn khô - từ các mẫu cấy trong môi trường lỏng -.

2. Để không khí khô khỏi bật lửa.

3.- Nếu vết bẩn đến từ việc nuôi cấy trong môi trường rắn, vết bẩn khô được cố định bằng nhiệt, truyền nhanh từ 2 đến 3 lần qua phần nóng nhất của ngọn lửa nhẹ hơn.

4.- Chạm vào phần dưới của vết bẩn với phần lưng của tay trái (đối với người thuận tay phải; nếu không, hãy sử dụng tay phải) và kiểm tra xem nó có lạnh không.

C. Nhuộm đơn giản

1.- Thêm 2 giọt vết bẩn đã chọn vào vết bẩn và để nó hoạt động trong thời gian cần thiết trong các quy trình cụ thể cho mỗi vết bẩn (thường từ 1 đến 5 phút).

2.- Một số vết bẩn cần sử dụng nhiệt để kích hoạt chúng, trong trường hợp đó, cần phải hết sức cẩn thận khi nung phiến kính trên ngọn lửa nhẹ (thao tác bằng nhíp và tránh đun sôi). Việc bôi quá nóng có thể phá hủy các tế bào được quan sát.

3. Loại bỏ chất tạo màu thừa bằng cách rửa bằng nước cất từ ​​một chiếc picette. Loại bỏ nước rửa bằng cách gõ nhẹ vào thanh trượt trên cạnh của nó, nghiêng trên bàn làm việc.

4.- Để khô không khí.

5.- Tùy thuộc vào loại quan sát, một tấm bìa được sử dụng hoặc không ở giai đoạn này. Kẹp che phủ bảo vệ và bảo quản vết bẩn. Nếu quan sát ngâm dầu được thực hiện ở giai đoạn này, không sử dụng các tấm phủ nhưng vết bẩn không thể bảo quản.

D. Bảo quản dứt điểm vết bẩn

1. Nhúng vết bẩn liên tiếp vào từng dung dịch được chỉ dẫn dưới đây, tối thiểu 5 phút. Mục đích của những lần "tắm" này là để làm mất nước hoàn toàn vết bẩn. Mỗi thuốc thử phải được làm ráo nước hoàn toàn trước khi đưa vết bẩn vào bể tiếp theo.

Thứ tự của các bồn tắm khử nước như sau:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Axeton nguyên chất
4. Hỗn hợp axeton -xylol 1: 1
5. Xylol

Sau đó để khô ngoài không khí.

2.- Gắn tấm che, tốt nhất là 22 × 22 mm, sử dụng Canada balsam hoặc phương tiện lắp khác.

Người giới thiệu

1. Briggs, G. (1965). Các Yếu tố Nhân quả trong Tai nạn và Nhiễm trùng Phòng thí nghiệm Vi sinh. Phòng thí nghiệm sinh học của quân đội Hoa Kỳ. Pháo đài Detrick.
2. Cappucino, JG và Welch, CT (2017). Vi sinh: Sổ tay hướng dẫn phòng thí nghiệm. Lề.
3. Holt, Biên tập viên JG. (1977). Sổ tay hướng dẫn vi khuẩn học xác định của Bergey càng ngắn. Baltimore ^thứ 8 : Williams và Wilkins Co.
4. Johnson, TR và Case; CL (2018). Thí nghiệm trong phòng thí nghiệm trong vi sinh. Lề.
5. Tille, P. (2017). Vi sinh chẩn đoán. 14 ^thứ St. Louis, USA: Elsiever, Inc.