MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG: CƠ SỞ LÝ LUẬN, GIAO THỨC VÀ ỨNG DỤNG - SINH HỌC - 2026

Các miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật mạnh mẽ nhuộm miễn dịch sử dụng kháng thể đồng hóa trị liên kết với các phân tử huỳnh quang để xác định mục tiêu cụ thể trong các mẫu tế bào cố định trên một sự hỗ trợ vững chắc.

Kỹ thuật này liên quan đến việc quan sát bằng kính hiển vi với tính đặc hiệu miễn dịch, giúp quan sát các tế bào sống hoặc chết có thể chứa một lượng kháng nguyên rất nhỏ. Nó được sử dụng rộng rãi cả trong lĩnh vực nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng các bệnh lý khác nhau.

Ghi nhãn miễn dịch của các sợi actin trong tế bào cơ tim (Nguồn: Ps1415 qua Wikimedia Commons)

Kỹ thuật này, chủ yếu là định tính (với một số biến thể định lượng), phải thực hiện cụ thể với việc hình dung mẫu bằng tín hiệu sản phẩm của fluorophore, là phân tử huỳnh quang liên kết với kháng thể và có khả năng bị kích thích ở một bước sóng nhất định .

Trong bối cảnh tế bào, rất hữu ích để nghiên cứu sự hiện diện / vắng mặt và vị trí dưới tế bào của protein. Kỹ thuật này ban đầu được sử dụng trong môi trường lâm sàng để chẩn đoán các loại virus như cúm và sau đó là nhiều bệnh truyền nhiễm khác.

Đây là một kỹ thuật có độ nhạy cao và với thiết bị hiển vi thích hợp, nó có thể có độ phân giải rất tốt. Để quan sát, nó đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi đồng tiêu hoặc huỳnh quang.

Tuy nhiên, mặc dù rất phổ biến, nó có thể gây ra một số vấn đề quan trọng liên quan đến việc thu được huỳnh quang không đặc hiệu tạo ra một số "nhiễu" nền, thường hạn chế việc đọc kết quả đầy đủ.

Nền tảng

Miễn dịch huỳnh quang dựa trên việc khai thác hiện tượng sinh học của phản ứng tương tác giữa kháng thể và kháng nguyên. Nó phải làm cụ thể với việc hình dung hoặc phát hiện phản ứng này bằng các phân tử huỳnh quang kích thích đến một bước sóng cụ thể.

Kháng thể là một protein globulin miễn dịch được tiết ra từ các tế bào B hoạt động, được tạo ra đặc biệt chống lại một kháng nguyên, mà nó có thể liên kết với ái lực và độ đặc hiệu cao. Miễn dịch huỳnh quang sử dụng các globulin miễn dịch IgG, được tìm thấy hòa tan trong huyết thanh.

Kháng thể là những phân tử có kích thước lên đến 950 kDa được tạo thành từ hai chuỗi peptit ngắn (nhẹ) và hai chuỗi peptit dài hình chữ “Y” (nặng). Cả chuỗi nhẹ và chuỗi nặng đều được chia thành hai vùng: một vùng biến đổi, có khả năng nhận biết kháng nguyên và vùng khác không đổi hoặc được bảo tồn, là đặc trưng của mỗi loài.

Về mặt chức năng, kháng nguyên được định nghĩa là các phân tử có thể được nhận biết bởi kháng thể và phần lớn là protein. Khi một con vật tiếp xúc với một kháng nguyên, các tế bào lympho của hệ thống miễn dịch sẽ được kích hoạt, tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống lại nó và hoạt động như một hệ thống phòng thủ.

Một kháng nguyên, chẳng hạn như protein, chẳng hạn, có thể có nhiều hơn một biểu mô hoặc vị trí được kháng thể nhận biết, do đó huyết thanh của động vật tiếp xúc với kháng nguyên có thể có kháng thể đa dòng chống lại các vùng khác nhau của cùng một loại protein.

Sau đó, miễn dịch huỳnh quang khai thác khả năng của động vật tạo ra kháng thể đa dòng chống lại một kháng nguyên cụ thể để làm sạch nó và sau đó sử dụng nó để phát hiện cùng một kháng nguyên trong các bối cảnh khác.

Trong số các chất nhuộm hoặc phân tử huỳnh quang được sử dụng nhiều nhất cho một số kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang là fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 và 6 (TRITC), nhiều cyanine như Cy2, Cy3, Cy5 và Cy7 và thuốc nhuộm được gọi là Alexa Fluor® , chẳng hạn như Alexa Fluor®448.

Giao thức

Quy trình miễn dịch huỳnh quang thay đổi tùy thuộc vào nhiều yếu tố, tuy nhiên, nói chung, nó bao gồm một chuỗi các bước tuyến tính bao gồm:

• Chuẩn bị đĩa và tế bào
• Định hình mẫu
• Thẩm thấu
• Chặn
• Nhuộm miễn dịch hoặc nhuộm miễn dịch
• Lắp ráp và quan sát

-Sự chuẩn bị

Trong số các mẫu

Việc chuẩn bị các mẫu sẽ phụ thuộc vào bản chất của chúng và loại kinh nghiệm được thực hiện. Trường hợp đơn giản nhất, liên quan đến việc sử dụng các tế bào ở dạng huyền phù, sẽ được giải thích dưới đây.

Tế bào ở thể huyền phù, nghĩa là, trong môi trường nuôi cấy lỏng, trước tiên phải được tách ra khỏi nó bằng cách ly tâm và sau đó phải được rửa bằng dung dịch đệm hoặc "đệm" đẳng tích, để bảo toàn tính toàn vẹn của chúng.

Thông thường, người ta sử dụng dung dịch đệm muối-photphat được gọi là PBS, trong đó các tế bào được gắn lại và hỗn hợp này được ly tâm một lần nữa để thu được các tế bào không có môi trường nuôi cấy, có thể chứa các chất gây nhiễu.

Của những lưỡi

Các slide được sử dụng để quan sát bằng kính hiển vi, nơi các tế bào sau này sẽ được cố định cho các phương pháp xử lý xuôi dòng tương ứng, cũng phải được chuẩn bị cẩn thận.

Chúng được bao phủ hoặc "nhạy cảm" bằng dung dịch poly-lysine, một loại polyme tổng hợp sẽ hoạt động như một "keo phân tử" giữa các tế bào và giá đỡ vững chắc, nhờ tương tác tĩnh điện giữa các điện tích dương của các nhóm amin của chúng và điện tích âm trên các protein bao phủ tế bào.

Định hình mẫu

Quá trình này bao gồm việc cố định các protein được tìm thấy bên trong tế bào để giữ nguyên vị trí không gian của chúng. Các phân tử được sử dụng phải có khả năng vượt qua tất cả các loại màng tế bào và tạo thành mạng lưới với các protein cộng hóa trị.

Formaldehyde và paraformaldehyde, glutaraldehyde và thậm chí metanol được sử dụng rộng rãi, trong đó các mẫu tế bào được ủ trong một thời gian nhất định và sau đó được rửa bằng dung dịch đệm đẳng tích.

Sau khi cố định các tế bào, chúng tiếp tục được gắn vào các tấm đã được mẫn cảm với poly-lysine trước đó.

Thẩm thấu

Tùy thuộc vào loại thử nghiệm được thực hiện, nó sẽ cần thiết để làm thấm các tế bào được nghiên cứu hay không. Nếu điều cần tìm là biết vị trí, sự hiện diện hay vắng mặt của một loại protein nhất định trên bề mặt tế bào, thì sự ổn định thẩm thấu sẽ không cần thiết.

Mặt khác, nếu bạn muốn biết vị trí của một protein bên trong tế bào, thì quá trình thẩm thấu là điều cần thiết và sẽ bao gồm việc ủ các mẫu với Triton X-100, một chất tẩy rửa có khả năng thấm qua màng tế bào.

Chặn

Một bước cơ bản trong tất cả các kỹ thuật miễn dịch học là ngăn chặn. Ở giai đoạn này của quy trình, việc ngăn chặn bao gồm việc phủ, trên các tấm nhạy cảm, tất cả các vị trí có phân tử poly-lysine mà tế bào không bám vào. Có nghĩa là, nó ngăn cản bất kỳ liên minh không cụ thể nào.

Thông thường, các giải pháp ngăn chặn có albumin huyết thanh bò (BSA) trong đệm PBS được sử dụng và thu được kết quả tốt nhất khi thời gian ủ với dung dịch này càng lâu. Sau mỗi bước, bao gồm cả việc chặn, cần phải rửa sạch dung dịch còn sót lại.

Nhuộm miễn dịch hoặc nhuộm miễn dịch

Quy trình nhuộm hoặc nhuộm miễn dịch sẽ phụ thuộc chủ yếu vào việc nó là phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hay gián tiếp (xem bên dưới).

Nếu là miễn dịch huỳnh quang chính hoặc trực tiếp, các mẫu sẽ được ủ với các kháng thể mong muốn, các kháng thể này phải được kết hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang. Quy trình ủ bao gồm việc pha loãng kháng thể trong dung dịch cũng sẽ chứa BSA nhưng với tỷ lệ thấp hơn.

Khi trường hợp là miễn dịch huỳnh quang thứ cấp hoặc gián tiếp, nên tiến hành hai lần ủ liên tiếp. Đầu tiên với các kháng thể mong muốn và sau đó với các kháng thể có khả năng phát hiện các vùng không đổi của các globulin miễn dịch chính. Chính những kháng thể thứ cấp này được liên kết cộng hóa trị với các fluorophores.

Kỹ thuật này rất linh hoạt, cho phép ghi nhãn đồng thời nhiều hơn một kháng nguyên trên mỗi mẫu, miễn là có các kháng thể chính kết hợp với các fluorophores khác nhau, trong trường hợp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp.

Để ghi nhãn đồng thời trong miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, cần phải đảm bảo rằng mỗi kháng thể chính được tạo ra ở một loài động vật khác nhau, cũng như mỗi kháng thể thứ cấp được ghép nối với một fluorophore khác nhau.

Giống như ngăn chặn, ủ với kháng thể cho kết quả tốt hơn khi thời gian này kéo dài. Sau mỗi bước, cần rửa sạch các kháng thể thừa không bám vào mẫu và trong miễn dịch huỳnh quang thứ cấp cần phải chặn trước khi bổ sung kháng thể thứ cấp.

Một số kỹ thuật sử dụng các vết bẩn khác không liên quan đến nhuộm miễn dịch, chẳng hạn như nhuộm DNA hạt nhân với DAPI fluorophore.

Lắp ráp và quan sát

Trong thời gian ủ cuối cùng với các fluorophores, cần để mẫu ở trong bóng tối. Để quan sát bằng kính hiển vi, người ta thường sử dụng một số chất để bảo tồn sự phát huỳnh quang của các fluorophores kết hợp với các kháng thể.

Các loại

Tóm tắt đồ họa về miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp (Nguồn: Westhayl618 qua Wikimedia Commons)

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hoặc sơ cấp

Nó liên quan đến việc phát hiện các kháng nguyên thông qua việc sử dụng các kháng thể huỳnh quang. Ưu điểm chính của việc sử dụng kỹ thuật này là tốc độ của nó, tuy nhiên, nhiều trường hợp liên kết không đặc hiệu có thể xảy ra trong quá trình này, đặc biệt khi nghiên cứu huyết thanh của người, vì chúng rất giàu kháng thể không đồng nhất.

Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp hoặc thứ phát

Nó còn được gọi là kỹ thuật "sandwich" và điều này liên quan đến sự phát triển của kỹ thuật này theo hai bước. Đầu tiên phải làm với việc sử dụng kháng thể không phát huỳnh quang và liên kết của nó với kháng nguyên quan tâm.

Chống lại vùng không đổi của kháng thể đầu tiên này (lúc này sẽ đóng vai trò là kháng nguyên), người ta sử dụng kháng thể thứ hai có khả năng nhận biết nó, được liên kết với phân tử huỳnh quang.

Sự xuất hiện của tín hiệu huỳnh quang sẽ là kết quả của sự nhận biết đặc hiệu giữa kháng thể không phát huỳnh quang đầu tiên và kháng nguyên quan tâm; sự hiện diện của kháng thể thứ nhất này xác định kháng thể thứ hai, được đánh dấu và nhờ đó có thể xác định được sự có mặt hay vắng mặt của kháng nguyên.

Mặc dù là một kỹ thuật tốn thời gian hơn nhiều so với phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (vì nó bao gồm thêm một bước ủ), kỹ thuật này không liên quan đến việc thiết kế một kháng thể huỳnh quang cho mỗi kháng nguyên được nghiên cứu, do đó, về mặt kinh tế, khả thi hơn.

Hơn nữa, đây là một kỹ thuật nhạy cảm hơn về mặt khuếch đại tín hiệu, vì nhiều hơn một kháng thể thứ cấp có thể liên kết với vùng không đổi của kháng thể chính, do đó khuếch đại cường độ của tín hiệu huỳnh quang.

Các ứng dụng

Như có thể đã lưu ý trước đây, miễn dịch huỳnh quang là một kỹ thuật cực kỳ linh hoạt, đã được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khoa học và lâm sàng. Nó có thể được sử dụng để trả lời các câu hỏi sinh thái, di truyền và sinh lý học liên quan đến nhiều sinh vật.

Trong số các ứng dụng lâm sàng, nó được sử dụng để chẩn đoán trực tiếp một số bệnh da liễu, sử dụng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp hoặc gián tiếp trên mô biểu mô của những bệnh nhân được nghiên cứu.

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang đã có sẵn trong các sinh vật đơn bào như nấm men để hình dung các vi ống nội nhân và tế bào chất, actin và các protein liên kết, sợi 10nm và các thành phần khác của tế bào chất, màng và thành tế bào.

Người giới thiệu

1. Abcam, Giao thức hóa tế bào miễn dịch và miễn dịch huỳnh quang. Lấy từ abcam.com
2. Greph, C. (2012). Thuốc nhuộm huỳnh quang. Lấy từ leica-microsystems.com
3. Miller, DM và Shakest, DC (1995). Kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang. Trong Các phương pháp trong Sinh học Tế bào (Tập 48, trang 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID & Cook, D. (2013). Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Tạp chí Da liễu Điều tra, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Phương pháp miễn dịch huỳnh quang đối với nấm men. Trong Phương pháp Enzymology (Tập 194, trang 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, & Widelock, D. (1964). Các ứng dụng của miễn dịch huỳnh quang trong Vi-rút Y tế Công cộng. Nhận xét về vi khuẩn học, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG và Anderson, DM (1996). Miễn dịch huỳnh quang trong nghiên cứu thực vật phù du: ứng dụng và tiềm năng. J: Phycol. , 32, 1–16.