MÔI TRƯỜNG LÖWENSTEIN-JENSEN: NỀN TẢNG, CHUẨN BỊ VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2025

Môi trường Löwenstein-Jensen là môi trường rắn chọn lọc để phân lập và phát triển các vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium, chẳng hạn như Mycobacterium tuberculosis, M. avium, trong số các loại khác, ngoại trừ loài leprae, không thể nuôi cấy.

Vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium không phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường, do đó cần thiết kế một môi trường đặc biệt để phân lập chúng. Phương tiện ban đầu được tạo ra bởi Löwenstein và sau đó được sửa đổi bởi Jensen.

Môi trường Löwenstein-Jensen với các khuẩn lạc của Mycobacterium tuberculosis. Nguồn: Agarwal và cộng sự / BioMed Central Ltd., được cung cấp bởi Thư viện Hình ảnh Sinh học

Việc sửa đổi bao gồm việc loại bỏ thuốc nhuộm màu đỏ Congo, thay thế nó bằng màu xanh lục malachit có nồng độ cao hơn. Nó cũng làm thay đổi nồng độ của magie citrat và monopotassium phosphate.

Môi trường Löwenstein-Jensen hiện chứa tinh bột khoai tây, asparagin, magie citrat, monopotassium phosphate, magie sulfat, xanh malachite, axit nalidixic, cycloheximide, lincomycin, trứng đánh tan, glycerin và nước.

Mycobacteria thường được phân lập từ những nơi không được vô trùng, chẳng hạn như đờm, nước tiểu, áp xe, trong số những nơi khác. Điều này có nghĩa là hầu hết các mẫu sẽ chứa hệ vi sinh vật thông thường của khu vực, cộng với mầm bệnh.

Đó là lý do tại sao môi trường Löwenstein-Jensen chứa một loạt các chất ức chế trong thành phần của nó được đại diện bởi màu xanh lá cây malachite, thuốc kháng sinh và thuốc chống nấm.

Ngoài ra, các mẫu lấy từ các vị trí không vô trùng phải được khử nhiễm và trung hòa trước khi được gieo vào môi trường Löwenstein-Jensen.

Nền tảng

Sự hiện diện của trứng và glycerin trong môi trường Löwenstein-Jensen kích thích sự phát triển của vi khuẩn mycobacteria vì chúng cung cấp các axit béo và protein cần thiết cho sự phát triển của các vi sinh vật này.

Môi trường Löwenstein-Jensen có chứa malachite green, là chất ức chế hệ vi sinh vật đi kèm. Nhưng nó cũng chứa axit nalidixic (35 µg / mL), ức chế hệ vi sinh vật Gram âm, cycloheximide (400 µg / mL), ức chế nấm và nấm men hoại sinh, và lincomycin (2 µ / mL), ức chế hệ vi sinh vật Gram dương.

Một số công ty thương mại thích thêm sự kết hợp của các kháng sinh sau: polymyxin B 200.000 đơn vị / L, amphotericin B 10 mg / L, carbenicillin 50 mg / L và trimethoprim 10 mg / L.

Môi trường này không chứa thạch, do đó sự đông đặc của môi trường xảy ra do sự đông tụ của albumin có trong trứng trong quá trình khử trùng.

Sự chuẩn bị

Cân 37,3 g môi trường khử nước trong 600 ml nước cất đã thêm 12 ml glyxerol trước đó. Hỗn hợp được đun nóng, khuấy thường xuyên cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Hấp môi trường ở 121 ° C trong 15 phút.

Mặt khác, hỗn dịch đồng nhất của 1000 ml trứng tươi cần được chuẩn bị trong điều kiện vô trùng. Cho hỗn dịch trứng vào 600 ml môi trường đã chuẩn bị ở nhiệt độ 50 - 60oC, tránh tạo bọt khí.

Dung dịch kháng sinh cũng được thêm vào sau khi khử trùng trong nồi hấp.

Đổ môi trường vào các ống nghiệm vô trùng có nắp vặn. Đun nóng các ống ở 85 ° C trong 45 phút theo tư thế nghiêng.

Màu của môi trường đã chuẩn bị là xanh lục lam và có thể có các đốm trắng do sự có mặt của lipid trứng.

Độ pH của môi trường phải là 7,2 ± 0,2

Bảo quản ống trong tủ lạnh và tránh ánh sáng trực tiếp cho đến khi sử dụng. Ủ trước khi gieo.

Có một sửa đổi của phương tiện được gọi là "Sửa đổi Gruft của Löwenstein Jensen". Môi trường này chứa các hợp chất tương tự như môi trường cổ điển nhưng RNA-5mg / 100 mL được thêm vào, và như chất ức chế, nó chứa malachite green 0,025 g / 100 mL, penicillin 50 U / mL và axit nalidixic 35 ug / mL.

Các ứng dụng

Môi trường Löwenstein-Jensen được sử dụng để phân lập vi khuẩn mycobacteria từ các loại mẫu khác nhau. Nên nhuộm Ziehl-Neelsen cho bất kỳ mẫu vật nào nghi ngờ có vi khuẩn mycobacteria.

Một số mẫu đến từ các địa điểm vô trùng nhưng những mẫu khác thì không. Các mẫu không vô trùng phải được khử nhiễm khi thích hợp:

Đờm

Các mẫu đờm cần được khử nhiễm như sau: định lượng mẫu đờm tính bằng ml và thêm cùng một lượng NaOH 4% vào mẫu và ủ ở 37 ° C.

Lắc hỗn hợp thường xuyên trong vòng 30 phút. Sau đó ly tâm ở 3000 RPM trong 30 phút.

Loại bỏ phần nổi phía trên qua dung dịch khử trùng phenol. Sử dụng chất lắng để gieo hạt, nhưng trước tiên độ pH phải được trung hòa.

Để trung hòa cặn lắng, H ₂ SO ₄ 5% được sử dụng với sự có mặt của chất chỉ thị màu đỏ phenol cho đến khi nó đạt đến độ pH trung tính tạo ra màu cá hồi.

Rửa dạ dày, rửa phế quản và hút dịch phế quản

Trong trường hợp này, mẫu phải được ly tâm ở 3000 vòng / phút trong 30 phút. Phần nổi phía trên được loại bỏ và phần viên được sử dụng. Để khử nhiễm cặn, thêm 3 ml NaOH 4% và khuấy thường xuyên ở 37 ° C trong thời gian nửa giờ.

Ly tâm một lần nữa, phần nổi phía trên được loại bỏ và phần viên được sử dụng. Sau đó phải được trung hòa như đã giải thích trong mẫu đờm.

Nước tiểu

Để mẫu lắng trong tủ lạnh trong 24 giờ. Tách phần nổi phía trên. Phần viên còn lại nên được ly tâm trong 30 phút ở 3000 RMP. Đổ bỏ phần nổi phía trên một lần nữa và hoàn nguyên viên bằng 3 ml dung dịch sinh lý vô trùng.

Thêm 3 ml NaOH 4% và tiến hành khử nhiễm và trung hòa như đã mô tả ở trên.

Dịch cổ trướng, dịch màng phổi, dịch não tủy

Trong loại mẫu này, nó được ly tâm và phần nổi phía trên được loại bỏ. Thực hiện Gram trên cặn hoặc quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi; Nếu không quan sát thấy vi khuẩn, bước khử nhiễm không cần thiết, cũng không phải là bước trung hòa.

Trong trường hợp này, mẫu có thể được gieo hạt trực tiếp bằng cách sử dụng trầm tích. Nếu có vi khuẩn thì tiến hành khử nhiễm và trung hòa như đã trình bày ở trên.

Sinh thiết

Đối với loại mẫu này, 5 ml nước cất phải được thêm vào máy ly tâm sau đó ở tốc độ 1500 vòng / phút trong 10 phút. Loại bỏ phần nổi phía trên và ly tâm lại viên ở 3500 vòng / phút trong 30 phút. Dùng bùn lắng để gieo vào môi trường nuôi cấy.

Tăm bông thanh quản

Gạc phải được đặt trong một ống vô trùng có chứa hai phần bằng nhau nước cất và 4% NaOH. Gạc phải được ép vào thành ống để mẫu được pha loãng trong chất lỏng. Ly tâm và sử dụng phần lắng. Trung hòa cặn như đã mô tả.

Gieo

Môi trường Löwenstein-Jensen được cấy bằng cách thêm 0,5 ml mẫu trên bề mặt môi trường. Xoay ống để phân phối mẫu khắp môi trường. Không sử dụng tay cầm bằng bạch kim.

Một ống thứ hai chứa môi trường Stonebrink có thể được gieo hạt để phân lập Mycobacterium bovis và các loài khác không phát triển trên môi trường Löwenstein-Jensen.

Ủ

Các ống cấy được ủ theo phương pháp hiếu khí ở 37 ° C, với nắp hơi lỏng và nghiêng khoảng 5 ° và tránh ánh sáng. Môi trường có thể được làm giàu với 5–10% carbon dioxide. Kiểm tra các mẫu cấy hai lần một tuần cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện.

Khi mẫu đã được hấp thụ, các nắp được vặn chặt. Thời gian ủ bệnh tối đa là 8 tuần, nếu sau thời gian này mà không thấy phát triển thì báo là âm tính.

QA

Các chủng sau đây có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Cryptococcus pyogenes 32015 ATCCofatococcus 32015, Cryptococcus pyogenes ATCCofof

Dự kiến ​​sẽ có sự phát triển tốt đối với ba loài đầu tiên được đề cập, đối với M. fortuitum sinh trưởng tốt, trong khi M. bovis tăng trưởng ít hoặc không có. Trong khi đó, các loài khác ngoài chi Mycobacterium phải bị ức chế hoàn toàn.

Hạn chế

Môi trường đã pha chế phải tránh ánh sáng, tiếp xúc lâu với ánh sáng làm môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh lam, trường hợp này môi trường không sử dụng được nữa. Điều này là do màu xanh lục malachit là chất cảm quang.

Môi trường, vì nó có chứa trứng, có thể dễ dàng bị nhiễm bẩn nếu nó không được xử lý vô trùng. Nó có thể bị hòa tan nếu bị nhiễm vi khuẩn phân giải protein.

Việc nuôi cấy và thao tác vi khuẩn thuộc giống Mycobacterium đòi hỏi nhân viên có trình độ chuyên môn, những người biết các biện pháp an toàn sinh học phải được tuân thủ để tránh bị ô nhiễm hoặc lây nhiễm sang người khác.

Không nên sử dụng HCl trong bước trung hòa do tạo thành natri clorua, có thể gây độc cho trực khuẩn Koch.

Mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh và tránh ánh sáng khi chưa xử lý.

Tài liệu tham khảo

1. Phòng thí nghiệm Francisco Soria Melguizo. 2009. Môi trường chọn lọc Löwenstein-Jensen. Có sẵn tại: f-soria.es
2. Phòng thí nghiệm Britannia. 2017. Phương tiện Löwenstein-Jensen. Có sẵn tại: britanialab.com.
3. Phòng thí nghiệm Neogen. Phương tiện Löwenstein-Jensen. Có tại: Foodsafety.neogen.com.
4. "Phương tiện Löwenstein-Jensen." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 20 tháng 11 năm 2018, 15:15 giờ UTC. Ngày 24 tháng 4 năm 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Các xét nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn có tầm quan trọng lâm sàng. Ấn bản thứ 3. Biên tập Panamericana. Buenos Aires. Argentina.