PROTEINASE K: ĐẶC ĐIỂM, HOẠT TÍNH CỦA ENZYM, ỨNG DỤNG - SINH HỌC - 2025

Các proteinase K là một loại enzyme thuộc nhóm protease serine, tức là nó có trong một trung của nó hoạt động xúc tác axit amin serine và có chức năng phá vỡ liên kết peptit bằng cách thủy phân. Đổi lại, enzym này thuộc họ protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K có trọng lượng phân tử (MW) là 28.900 dalton và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1974 trong chất chiết xuất từ ​​nấm Engyodontium album, trước đây được gọi là Tritirachium album Limber.

Cấu trúc phân tử của Proteinase K. Nguồn: Lykchiniadis

Nó có khả năng phân giải protein cao, được chứng minh bằng khả năng phân hủy keratin có trong tóc. Từ keratin trong tiếng Anh được đánh vần là "keratin", do đó nó được gọi là "proteinase K".

Do công suất cao để phân cắt các protein tự nhiên, enzyme này rất hữu ích trong các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau. Nó chủ yếu được sử dụng để phân lập và điều chế axit nucleic có trọng lượng phân tử cao (MW).

Proteinase K hoạt động bằng cách giải phóng DNA nhân, đồng thời phá hủy protein và làm bất hoạt RNase và DNase, tức là nó loại bỏ nuclease trong các chế phẩm DNA và RNA.

Mặt khác, người ta đã thấy rằng proteinase K có thể thủy phân một số protein bản địa bị biến tính, điều này đã khơi dậy sự quan tâm của các nhà nghiên cứu đối với việc sử dụng nó trong nghiên cứu protein prion (PrPC).

Tuy nhiên, mặc dù có hiệu lực phân giải protein cao, có những protein có khả năng chống lại hoạt động của proteinase K. Trong số đó có một số protein bất thường được gọi là prion (PrPSc), liên quan đến bệnh não xốp có thể truyền nhiễm.

Đặc điểm của proteinase K

Proteinase K có cấu trúc bậc ba được tạo thành từ ba lớp, với một tấm β bảy chuỗi xen kẽ giữa hai lớp xoắn. Vì nó thuộc họ peptidase S8, nó có đặc điểm là có một bộ ba xúc tác tại vị trí hoạt động của nó, có thứ tự tuần tự là (Asp, His và Ser), giúp phân biệt chúng với các họ peptidase khác.

Enzyme này từ nhóm serine protease có đặc điểm là thủy phân các liên kết peptit gần với nhóm cacboxylic của axit amin béo và thơm.

Mặt khác, nó có khả năng hoạt động khi có một số chất ăn mòn, chẳng hạn như natri dodecyl sulfat (SDS), Tris-HCL và EDTA, được sử dụng để giúp biến tính protein, khiến chúng mất đi cấu trúc ban đầu.

Đây là bước sơ bộ chuẩn bị protein cho kỹ thuật điện di. Phạm vi pH mà proteinase K hoạt động khá rộng (2,0 đến 12,0), với độ pH tối ưu từ 7,5 đến 12,0, và điểm đẳng điện của nó là 8,9. Có thể thấy, nó hoạt động chống lại phạm vi pH rất rộng.

Một đặc tính khác nổi bật của proteinase K là tính ổn định của nó trong điều kiện nhiệt độ cao (50-60 ° C).

Hoạt động enzym

Proteinase K yêu cầu sự hiện diện của ion canxi, mặc dù điều này không ảnh hưởng đến hoạt động của nó, nếu điều này là cần thiết để duy trì sự ổn định của nó.

Để proteinase K có thể tiêu hóa hoàn toàn cơ chất, thời gian tiếp xúc khoảng 5 phút đến 2 giờ là cần thiết.

Tuy nhiên, theo ý nghĩa này, Daza và cộng sự đã so sánh độ tinh khiết của DNA thu được tại các thời điểm tiếp xúc với proteinase K khác nhau và kết luận rằng thời gian ủ kéo dài (lên đến 24 giờ) cải thiện đáng kể chất lượng của DNA.

Tuy nhiên, liên quan đến nồng độ của enzyme proteinase K được sử dụng trong các quy trình khác nhau, có thể nói rằng nó rất khác nhau.

Nó có thể được sử dụng từ nồng độ rất thấp (5 µg / ml) đến nồng độ 500 µg / ml. Nhưng nồng độ làm việc phổ biến nhất nằm trong khoảng từ 50–100μg / ml, đặc biệt là để tiêu hóa protein và khử hoạt tính nuclease. Mặc dù để điều trị các mô, cần phải có nồng độ 2 mg / ml.

Các ứng dụng

Ứng dụng của nó rất rộng và có thể tóm tắt như sau:

-Nó được sử dụng trong quá trình phân hủy protein và chiết xuất DNA bằng nhiều phương pháp khác nhau như: salting-out, PK-SDS, cetyl-trimethyl amoni bromide (CTAB), kali axetat biến tính và chiết xuất bằng natri iodua.

-Kích hoạt các nuclease (RNases và DNases).

-Trong kỹ thuật lai tại chỗ (HIS), để hỗ trợ giải phóng axit nucleic, ngoài ra còn loại bỏ các protein không mong muốn.

-Sự biến đổi của protein.

- Ở cấp độ nghiên cứu, trong các nghiên cứu khác nhau.

Ưu điểm của proteinase K

Một số nghiên cứu so sánh đã được thực hiện giữa các kỹ thuật tách chiết DNA sử dụng Proteinase K với các kỹ thuật khác không sử dụng nó và tất cả đều kết luận rằng có những lợi ích lớn hơn khi sử dụng enzyme. Ưu điểm bao gồm những điều sau:

-DNA có khối lượng phân tử cao, chất lượng cao và độ tinh khiết thu được.

- DNA được tách chiết ổn định đến 3 tháng.

DNA chiết xuất có thể được sử dụng trong các kỹ thuật sau: Southern blot, phản ứng chuỗi polymerase (PCR), điện di, trong số các kỹ thuật khác.

Protein kháng proteinase K

Nhiều cuộc điều tra khác nhau đã kết luận rằng prion (protein PrPSc độc hại bất thường) khác với protein PrPC (bản địa) bởi khả năng chống lại hoạt động của proteinase K, trong khi PrPC nhạy cảm với hoạt động của nó.

Các tác giả khác đã mô tả rằng trong cấu trúc của PrPSc có những phần nhạy cảm và những phần khác kháng lại proteinase K. Tuy nhiên, cả hai phần đều độc và lây nhiễm như nhau.

Mặt khác, Bastian và cộng sự vào năm 1987 đã phân lập được 4 protein 28, 30, 66 và 76 kda từ một loài Spiroplasma mirum. Tất cả đều được phát hiện có khả năng chống lại hoạt động của proteinase K và cũng có phản ứng chéo với một số prion.

Được biết, loài này có thể gây đục thủy tinh thể và tổn thương thần kinh đáng kể và do phát hiện khoa học của Bastian, trong số các cuộc điều tra khác, một nỗ lực đã được thực hiện để liên kết vi sinh vật này với bệnh não xốp có thể truyền nhiễm.

Tuy nhiên, căn nguyên của bệnh lý thần kinh thoái hóa này vẫn tiếp tục được cho là do prion ngày nay.

Theo ý nghĩa này, Butler và cộng sự vào năm 1991 đã xác định và đặc trưng một lớp protein kháng proteinase K có kích thước 40 kda từ hai chủng Mycoplasma hyorhinis. Tác nhân gây bệnh này ảnh hưởng đến lợn, lây nhiễm sang mô của chúng, nhưng trong trường hợp này không có phản ứng chéo nào với các prion được thử nghiệm.

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để làm sáng tỏ nhiều ẩn số trong vấn đề này.

Người giới thiệu

1. Bastian F, Jennings R, và Gardner W. 1987. Kháng huyết thanh đối với protein fibril liên kết với phế phẩm phản ứng chéo với các protein fibril của Spiroplasma miru m. J. Clin. Vi sinh. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Đánh giá phương pháp tách chiết và tinh chế DNA từ mô cơ cố định bằng formaldehyde của những tử thi không xác định. Tạp chí Med, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, và Mcgarrity G. Nhận dạng và đặc điểm của protein kháng Proteinase K trong các thành viên của lớp Mollicutes. Nhiễm trùng và Miễn dịch, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. So sánh hai quy trình tách chiết DNA Trypanosoma cruzi được nuôi cấy trong môi trường axenic. Linh mục Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. Có tại: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E và Palma W. Xác định hiệu quả của năm quy trình tách chiết DNA từ vật liệu parafin hóa cho các nghiên cứu phân tử. Rev Méd Univ Costa Rica. Năm 2007; 1 (1): 10-19.