THỬ NGHIỆM OXYDASE: CƠ SỞ LÝ LUẬN, QUY TRÌNH VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2025

Các thử nghiệm oxidase là một phương pháp chẩn đoán rằng chương trình với sự có mặt của enzyme phức tạp gọi là cytochrome oxidase c. Hệ thống này tạo ra sự biến đổi cytochrome bị khử thành bị oxy hóa, vì nó bắt giữ oxy và đến lượt nó hoạt động như chất nhận điện tử cuối cùng (H ⁺ ) trong chuỗi hô hấp.

Thuật ngữ oxidase là cách gọi tắt của enzyme cytochrome oxidase, còn được gọi là indophenol oxidase. Trong thời cổ đại, người ta tin rằng enzyme cytochrome oxidase và indophenol oxidase là hai loại enzyme khác nhau, nhưng ngày nay chúng được biết là giống nhau.

Thử nghiệm oxidase dương tính và âm tính. Nguồn: Không cung cấp tác giả có thể đọc bằng máy. Alpha.prim ~ commonswiki giả định (dựa trên khiếu nại về bản quyền).

Về phần mình, cytochromes là những hemoprotein có chứa sắt và hoàn thiện hệ thống cytochrome oxidase. Các cytochromes có thể khác nhau giữa các loài.

Có nhiều loại cytochromes khác nhau (cytochromes a1, a2, a3 và 0). Một số vi khuẩn chỉ có thể tạo ra một con, nhưng những vi khuẩn khác có thể tạo ra đến hai hoặc ba con cùng một lúc. Theo nghĩa này, sự hiện diện của cytochrome a và a3 được gọi là cytochrome oxidase c. Đây là loại cytochrome mà xét nghiệm oxidase phát hiện.

Các chi Neisseria và Pseudomonas chứa cytochrome oxidase c. Các chi này cho xét nghiệm oxidase dương tính, giúp phân biệt chúng với các chi Acinetobacter và Stenotrophomonas tương ứng.

Ngoài ra còn có các chi khác dương tính với oxidase.

Nền tảng

Đặc điểm của hệ thống cytochrome oxidase c

Hệ thống cytochrome oxidase c hoạt động theo cách sau: các vi sinh vật dương tính với oxidase sử dụng oxy để tạo ra năng lượng thông qua quá trình hô hấp hiếu khí. Hệ thống này hoạt động nhờ sự vận chuyển các electron từ các chất cho như NADH ⁺ đến các chất tiếp nhận, trong trường hợp này là oxy.

Điều này dẫn đến việc sản xuất năng lượng (ATP) và nước hoặc hydrogen peroxide, tùy thuộc vào hệ thống cytochrome oxidase mà vi sinh vật sở hữu.

Đó là lý do tại sao hầu hết các vi khuẩn dương tính với oxidase cũng dương tính với catalase, một điều kiện cần thiết để loại bỏ hydrogen peroxide sinh ra, vì chất này gây độc cho vi khuẩn.

Hệ thống cytochrome oxidase c hiện diện ở một số vi khuẩn hiếu khí, một số vi khuẩn kỵ khí ưa thích, một số vi khuẩn ưa vi sinh và không có vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt. Điều thứ hai là dễ hiểu, vì vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt không thể sống trong điều kiện có oxy, do đó chúng thiếu hệ thống cytochrome oxidase.

Nguyên tắc kiểm tra

Trong thử nghiệm này, nó sử dụng các chất hoạt động như chất nhận điện tử nhân tạo, thay thế các chất tự nhiên trong chuỗi vận chuyển điện tử.

Chủ yếu, thuốc nhuộm như paraphenylenediamine và indophenol được sử dụng, hoạt động như chất nền thụ thể và chất cho điện tử nhân tạo.

Paraphenylenediamine bị oxy hóa bởi hệ thống cytochrome oxidase c. Thuốc nhuộm ở dạng khử của nó không màu, nhưng ở dạng oxy hóa nó có màu.

Đây là cách chứng minh sự hiện diện của hệ thống cytochrome oxidase c; vì phản ứng dương tính sẽ tạo ra màu hoa oải hương hoặc màu xanh tím tùy thuộc vào thuốc thử được sử dụng.

Ngược lại, nếu chất nhận electron cuối cùng trong chuỗi hô hấp khác với oxy thì thử nghiệm oxidase sẽ âm tính (không tạo màu); đây là trường hợp của vi sinh vật kỵ khí.

Tương tự như vậy, nếu cytochrome mà vi sinh vật sử dụng khác với cytochrome oxidase c, nó cũng sẽ cho kết quả âm tính.

Quá trình

Có nhiều loại thuốc thử và quy trình khác nhau cho phép thử oxidase, tất cả đều nhằm mục đích giống nhau.

Thuốc thử

Thuốc thử Kovacs, thuốc thử Gordon và McLeod, thuốc thử Nadi, thuốc thử Carpenter, Suhrland và Morrison, và sử dụng đĩa oxidase.

-Thuốc thử Kovacs oxidase

Nó được tạo thành từ 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride.

Thuốc thử Kovacs được điều chế bằng cách hòa tan 1 g chất nói trên trong 50 ml nước cất. Nó được làm nóng một cách tinh tế cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Chuyển vào bình hổ phách có dung tích vừa đủ và thêm nước cất đến vạch mức 100 ml. Chờ ít nhất 15 phút trước khi sử dụng. Bảo quản trong tủ lạnh tránh ánh sáng.

Nó được dán nhãn thuốc thử Kovacs oxidase, để phân biệt với thuốc thử Kovacs được sử dụng để tiết lộ thử nghiệm indole. Thuốc thử này là nhạy nhất, ít độc hơn nhưng đắt hơn các thuốc thử còn lại.

Phản ứng dương tính sẽ được chứng minh với thuốc thử này với sự thay đổi màu của khuẩn lạc thành màu oải hương, nhanh chóng chuyển sang màu tím gần như đen. Phản ứng âm tính là hiển nhiên bởi vì khuẩn lạc không có sự thay đổi màu sắc hoặc nó có màu hơi hồng. Môi trường cũng có thể tối đi, nhưng điều đó không có nghĩa là phản ứng tích cực.

Với thuốc thử này, thời gian phản ứng là tối quan trọng, sự thay đổi màu xảy ra trong khoảng từ 5 đến 15 giây được coi là phản ứng dương tính.

-Gordon và thuốc thử McLeod

Nó được tạo thành từ đimetyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, còn được gọi là N-dimethyl-p-phenylenediamine hoặc p-aminodimethylaniline monohydrochloride. Nó được chuẩn bị như được mô tả cho thuốc thử Kovacs oxidase, thay thế cho chất liên quan.

Thuốc thử này ổn định hơn một chút so với thuốc thử Kovacs oxidase, mặc dù tất cả các thuốc thử chứa p-phenylenediamine đều không bền.

Phản ứng này muộn hơn, nó được hiểu là dương tính với sự xuất hiện của màu xanh tím trong vòng 10 đến 30 phút.

Thuốc thử -Nadi

Nó bao gồm 1% α-naphthol trong rượu etylic (95% etanol) và 1% aminodimethylaniline. Hỗn hợp được chuẩn bị thành các phần bằng nhau và sử dụng rượu etylic tuyệt đối làm chất pha loãng, cho đến khi tạo đủ 100 ml.

-Carpenter, thuốc thử Suhrland và Morrison

Nó bao gồm 1% p-aminodimethylalanin oxalat. Chuẩn bị theo cách tương tự như đã mô tả đối với thuốc thử Kovacs oxidase, thay đổi chất tương ứng.

Chuẩn bị sẵn dung dịch, các que thử được chuẩn bị như sau: Que giấy lọc Whatman số 1 dài 6-8 cm được tẩm thuốc thử 1% dimethyl-p-phenylenediamine oxalat.

Chúng được để khô mà không tiếp xúc với kim loại, bảo quản trong lọ có nắp vặn với chất hút ẩm và bảo quản trong tủ lạnh. Các dải này ổn định đến 6 tháng.

Đây là loại thuốc thử ổn định nhất trong số những chất đã đề cập và có thể tồn tại đến 6 tháng trong dung dịch. Một điểm cộng nữa là nó không tạo màu cho môi trường xung quanh khuẩn lạc, nếu nó được sử dụng trực tiếp trên đĩa.

Xuất hiện màu đỏ được hiểu là xét nghiệm dương tính.

-Đĩa oxydase

Chúng là các đĩa thương mại được tẩm thuốc thử để thử nghiệm oxidase. Có một số thương hiệu thương mại trên thị trường.

Việc sử dụng nó là khá thực tế, vì không cần chuẩn bị thuốc thử mới, tạo điều kiện thuận lợi cho công việc. Kết quả thu được là đáng tin cậy miễn là các đĩa được bảo quản đúng cách.

Giao thức

Phương pháp đĩa trực tiếp, phương pháp gián tiếp trên giấy và sử dụng đĩa có tẩm thuốc thử oxidase.

-Phương pháp bảng trực tiếp

2 hoặc 3 giọt bất kỳ thuốc thử nào đã nói ở trên được thêm trực tiếp vào (các) khuẩn lạc chứa trong đĩa môi trường nuôi cấy không chứa glucose.

Sự thay đổi hoặc không thay đổi màu sắc của các khuẩn lạc được hiểu chứ không phải do môi trường. Thời gian phản ứng hợp lệ phụ thuộc vào thuốc thử được sử dụng.

-Phương pháp gián tiếp trên giấy

Cắt một mảnh giấy lọc (Whatman số 1) với kích thước 6 cm ² và đặt nó vào bên trong một đĩa Petri rỗng.

Nhỏ 2 hoặc 3 giọt thuốc thử Kovacs oxidase lên giấy, lấy một phần khuẩn lạc cần nghiên cứu bằng cán platin hoặc tăm gỗ rồi phết theo đường thẳng trên giấy tẩm thuốc thử. Giải thích trong vòng 5 đến 10 giây.

Với các dải được chuẩn bị bằng thuốc thử Carpenter, Suhrland và Morrison, một khuẩn lạc được trải trên dải khô. Một dải đơn được sử dụng để kiểm tra một số chủng. Phiên dịch trong 10 giây.

-Disks (m

Làm ẩm sâu các đĩa thương mại bằng nước cất vô trùng và chồng lên khuẩn lạc cần nghiên cứu. Nên sử dụng đĩa ở nhiệt độ 35 ° C, nếu sử dụng đĩa ở nhiệt độ phòng hoặc đĩa trong tủ lạnh thì phản ứng chậm hơn một chút. Diễn giải sự thay đổi màu trong khoảng từ 10 đến 20 giây.

Có thể sử dụng khuẩn lạc có trên thạch sô cô la hoặc máu.

-Disks (phương pháp gián tiếp)

Làm ẩm đĩa như đã mô tả trước đó. Đặt nó vào một đĩa Petri trống. Lấy một lượng khuẩn lạc vừa đủ để nghiên cứu bằng tay cầm bằng bạch kim hoặc tăm gỗ rồi đặt lên đĩa. Diễn giải sự thay đổi màu trong khoảng từ 10 đến 20 giây.

Sử dụng

Chi Neisseria và Acinetobacter đôi khi rất giống nhau về mặt hình thái bởi vì mặc dù chi Acinetobacter là một thanh Gram âm, nhưng đôi khi nó có thể có dạng coccoid và phân bố thành từng cặp, mô phỏng chi Neisseria.

Trong trường hợp này, thử nghiệm oxidase thực sự hữu ích. Chi Neisseria dương tính và Acinetobacter âm tính.

Tuy nhiên, chi Moraxella rất giống với chi Neisseria và cả hai đều cho phản ứng dương tính; Đây là lý do tại sao các phép thử lên men carbohydrate luôn phải được thực hiện để xác định chính xác.

Mặt khác, xét nghiệm oxidase rất hữu ích để phân biệt vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae (tất cả đều âm tính với oxidase) với các loài lên men khác, chẳng hạn như chi Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase dương tính).

Chi Vibrio và Helicobacter cũng dương tính với oxidase.

QA

Sử dụng các chủng Escherichia coli đã biết làm đối chứng âm tính và các chủng Pseudomonas aeruginosa làm đối chứng dương tính.

Hạn chế

- Thuốc thử phải dùng mới pha chế, thời hạn sử dụng trong dung dịch ở nhiệt độ phòng ngắn vì rất kém bền. Để trong tủ lạnh, chúng có thể để được từ 5 ngày đến 2 tuần.

- Thuốc thử không màu, nếu đổi màu phải bỏ. Đĩa bị hỏng xuất hiện vì chúng tối dần theo thời gian.

- Phản ứng dương tính với thuốc thử Kovacs oxidase trong khoảng từ 15-60 giây được coi là phản ứng chậm và sau 60 giây được coi là âm tính.

-Haemophylus influenzae cho phản ứng oxy hóa âm tính nếu sử dụng bất kỳ thuốc thử nào với dimethyl-p-phenylenediamine, nhưng dương tính nếu sử dụng thuốc thử Kovacs oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine).

-Medium chứa glucose cản trở xét nghiệm, cho âm tính giả.

-Các chủng vi khuẩn ho gà có thể cho phản ứng dương tính giả nếu chúng đến từ các đĩa thạch máu đậm đặc.

-Sử dụng tay cầm bằng kim loại (sắt) cho phản ứng dương tính giả.

khuyến nghị

- Vì thuốc thử rất không ổn định và có xu hướng tự oxy hóa, nên làm đông các phần nhỏ từ 1 đến 2 ml và loại bỏ khi cần thiết.

- Một cách khác để làm chậm quá trình tự oxy hóa của thuốc thử là thêm 0,1% axit ascorbic khi chuẩn bị thuốc thử.

-Như thuốc thử không ổn định, nên kiểm tra chất lượng hàng tuần.

-Những sinh viên không đạt yêu cầu kiểm tra chất lượng không được sử dụng.

Người giới thiệu

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
3. "Thử nghiệm Oxidase." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 15 tháng 1 năm 2018, 10:32 giờ UTC. 3 tháng 4, 2019, 14:03
4. Tổ chức Y tế Thế giới. Sổ tay hướng dẫn phòng thí nghiệm về việc xác định và kiểm tra tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh có tầm quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng ở các nước đang phát triển, 2004. Có tại: who.int/drugresistance/infosharing
5. Các dải thuốc thử để chẩn đoán hoạt động của oxidase ở vi khuẩn. Rev Cubana Med Trop. Năm 2000; 52 (2): 150-151.