GIẢI TRÌNH TỰ DNA: MAXAM-GILBERT, PHƯƠNG PHÁP VÀ VÍ DỤ - SINH HỌC - 2026

Giải trình tự DNA (deoxyribonucleic acid) là một thủ tục trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử cho phép biết thứ tự của các nucleotide trong vật liệu di truyền quan tâm. Hơn nữa, trình tự của RNA (axit ribonucleic) cũng có thể được tiết lộ.

Kỹ thuật này đã không thể thiếu đối với sự phát triển của khoa học sinh học. Nó cũng có thể áp dụng cho các lĩnh vực kiến ​​thức khác - chẳng hạn như chẩn đoán y tế và điều tra pháp y.

Nguồn: pixabay.com

Trước đây, việc xác định trình tự của một sợi DNA được coi là một hoạt động chậm và tốn kém, cho phép xác định chỉ một vài cặp bazơ trong các oligonucleotide.

Ngày nay, với tất cả những tiến bộ của khoa học, giải trình tự DNA là một hoạt động thường xuyên trong nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới nhờ đóng góp của gần 50 năm nghiên cứu trong lĩnh vực này. Về chiều dài chuỗi, lên đến hàng triệu cặp cơ sở có thể được sắp xếp theo trình tự trong một thời gian rất ngắn.

Để làm được điều này, có hàng chục kỹ thuật được phát triển khác nhau về giá cả và độ chính xác. Trong bài viết này, chúng tôi sẽ mô tả cả kỹ thuật cổ điển và kỹ thuật hiện đại, mỗi kỹ thuật đều có ưu và nhược điểm.

Cho đến nay, kỹ thuật giải trình tự cho phép thu được trình tự của các bộ gen hoàn chỉnh, từ các sinh vật nhân sơ nhỏ và nấm men đến bộ gen người.

Cấu trúc DNA

Để hiểu các phương pháp và kỹ thuật được sử dụng để giải trình tự DNA, cần phải biết các khía cạnh chính nhất định về cấu trúc và thành phần của phân tử.

DNA là một phân tử sinh học được tìm thấy trong tất cả các sinh vật sống, từ vi khuẩn đến các động vật thủy sinh lớn. Các bào quan - như ti thể và lục lạp - có một phân tử DNA hình tròn bên trong chúng. Thậm chí ở một số loại virus, vật liệu di truyền được tìm thấy là DNA.

Về mặt cấu trúc, DNA là một tập hợp các nucleotide. Mỗi loại được tạo thành từ một carbohydrate, một bazơ nitơ (A, T, C hoặc G) và một nhóm phốt phát. Mục tiêu của giải trình tự DNA là tiết lộ thứ tự mà bốn bazơ nitơ được tìm thấy trong trình tự.

Lịch sử

Vào giữa những năm 1950, các nhà nghiên cứu Watson và Crick đã mô tả cấu trúc của DNA bằng cách sử dụng các kỹ thuật vẽ hình thần thánh. Tuy nhiên, không ai trong số những nhà nghiên cứu này có thể tìm ra cách để làm sáng tỏ trình tự.

Mặc dù đã có những người đi trước nhất định nhưng sự kiện quan trọng nhất là sự ra đời của phương pháp Sanger, vào năm 1977. Frederick Sanger, cha đẻ của phương pháp này, là một nhà hóa sinh người Anh, từng đoạt hai giải Nobel vì những đóng góp to lớn của ông cho ngành khoa học sinh học.

Kỹ thuật này còn được gọi trong y văn là "kết thúc chuỗi" hoặc dideoxynucleotides. Các nguyên tắc của kỹ thuật này và những nguyên tắc được phát triển dựa trên sự cải tiến và đổi mới của nó sẽ được mô tả dưới đây.

Phương pháp Sanger

Sự phát triển của phương pháp Sanger đại diện cho một sự kiện quan trọng trong sinh học phân tử. Nó liên quan đến các thành phần cơ bản của quá trình sao chép DNA thường xảy ra trong tế bào, nhưng có thêm một thành phần đặc biệt: dideoxynucleotides.

Các thành phần chính của phản ứng

- DNA polymerase: enzyme DNA polymerase là yếu tố quan trọng của quá trình. Phân tử này tham gia vào quá trình sao chép sợi DNA và vai trò của nó là tổng hợp sợi mới, ghép nối các deoxyribonucleotide triphosphate với các phần bổ sung.

Nhớ lại rằng trong DNA, thymine (T) bắt cặp với adenines (A) thông qua hai liên kết hydro, trong khi cytosine (C) làm như vậy với guanine (G) thông qua ba liên kết.

- Nucleotide: Giải trình tự bậc cao liên quan đến hai loại nucleotide, bốn 2'-deoxynucleotide (viết tắt là dATP, dGTP, dCTP và dTTP) và bốn dideoxynucleotide (ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP).

Mặc dù dideoxynucleotide tương tự như các đơn phân thường được kết hợp vào DNA, nhưng chúng thiếu nhóm -OH trong cấu trúc của chúng. Điều này làm cho không thể thêm nucleotide mới vào chuỗi.

Do đó, khi một nucleotide đặc biệt được thêm vào - một cách hoàn toàn ngẫu nhiên - vào chuỗi đang hình thành, quá trình tổng hợp sẽ bị tê liệt. Do đó, khi kết thúc phản ứng, có các chuỗi có kích thước khác nhau, mỗi chuỗi nơi phản ứng dừng lại ở một điểm khác nhau.

Thực nghiệm, bốn bài kiểm tra được chuẩn bị. Mỗi loại chứa DNA được chiết xuất từ ​​mẫu sinh học quan tâm, các nucleotide bình thường và một trong bốn loại nucleotide đặc biệt. Các nucleotide đặc biệt được đánh dấu bằng một số loại marker huỳnh quang (xem giải trình tự tự động bên dưới).

Đọc kết quả

Bước đầu tiên là tách từng chuỗi tổng hợp theo kích thước của chúng. Một số sẽ dài hơn những cái khác, tùy thuộc vào nơi các căn cứ đặc biệt được kết hợp.

Có các kỹ thuật sinh hóa khác nhau cho phép tách các thành phần của hỗn hợp bằng cách sử dụng kích thước như một đặc tính phân biệt. Trong phương pháp của Sanger, các chuỗi khác nhau được phân tách bằng điện di. Trong các biến thể phức tạp hơn của kỹ thuật, phương pháp điện di mao quản được sử dụng.

Do đó, các sợi dài hơn di chuyển ít hơn các biến thể ngắn hơn. Hệ thống này sau đó đi qua một đầu đọc để nhận ra điểm đánh dấu có trong mỗi dideoxynucleotide. Bằng cách này, thứ tự của dãy có thể được biết.

Kỹ thuật "thế hệ đầu tiên" này có khả năng đọc các đoạn DNA không lớn hơn 1 kilobase. Hiện tại, phương pháp Sanger được sử dụng trong các phòng thí nghiệm khác nhau, nói chung là trong các biến thể hiện đại của nó. Ngoài ra, nó được sử dụng để chứng thực kết quả thu được bằng các kỹ thuật phức tạp nhất - nhưng kém chính xác hơn.

Giải trình tự tự động

Khi yêu cầu giải trình tự trên quy mô lớn, quá trình được tăng tốc thông qua tự động hóa. Đây là một biến thể của phương pháp kết thúc chuỗi Sanger, trong đó các mồi được dán nhãn bằng các sản phẩm huỳnh quang để phân biệt chúng.

Sau đó, sản phẩm phản ứng được chạy trong điện di - tất cả trên một làn đường duy nhất. Khi mỗi mảnh thoát ra khỏi phần cuối cùng của gel, nó nhanh chóng được xác định bằng cách ghi nhãn huỳnh quang, với sai số xung quanh 1%.

Các hệ thống phức tạp nhất có một hệ thống lên đến 96 ống mao dẫn được quản lý bởi một máy tính kết hợp với một robot. Nghĩa là, 96 mẫu DNA có thể được kiểm tra đồng thời. Do đó, quá trình liên quan đến điện di và phân tích kết quả là hoàn toàn tự động.

Trong một ngày, các hệ thống này có thể trình tự lên tới 550.000 căn cứ. Trong quá trình này, sức lao động của con người là không cần thiết, chỉ mất khoảng 15 phút để bắt đầu phương pháp.

Giải trình tự Maxam-Gilbert

Cùng thời điểm Sanger xuất bản công trình của mình, hai nhà nghiên cứu tên là Allan Maxan và Walter Gilbert đã thành công trong việc phát triển một phương pháp khác để thu được trình tự DNA. Phương pháp này đã trở nên phổ biến vào thời điểm đó, nhưng sau đó đã bị thay thế bởi sự cải tiến của phương pháp Sanger.

Trái ngược với phương pháp Sanger, giải trình tự Maxan và Gilbert (hay còn gọi là giải trình tự hóa học) không liên quan đến phản ứng lai. Phương pháp này bao gồm việc dán nhãn với các chất phản ứng ở một đầu, sau đó là quá trình tinh chế.

Một trong những mặt tiêu cực của kỹ thuật này nằm ở độ phức tạp to lớn của nó và việc sử dụng các hóa chất gây nguy hiểm cho người sử dụng. Sự phá vỡ hóa học được gây ra bằng cách áp dụng DMS, axit formic, hydrazine và hydrazine với các muối.

Quá trình

Quy trình bắt đầu với việc ghi nhãn ở đầu 5 'của sợi với điểm đánh dấu phốt pho 32, sau đó một biến đổi hóa học của bazơ nitơ xảy ra và nó được tách ra. Cuối cùng, sự phân cắt của vùng abasic xảy ra.

Đầu tiên, bạn rút ngắn chuỗi mà bạn muốn xâu chuỗi thành các đoạn nhỏ hơn. Bước này được thực hiện với các enzym giới hạn, dẫn đến các đầu nhô ra.

Tiếp theo, phản ứng được thực hiện với một phosphatase kiềm, mục đích là loại bỏ nhóm phosphat. Do đó, một polynucleotide kinase có thể được sử dụng để thực hiện việc ghi nhãn.

Chuỗi bị biến tính (hai sợi mở ra). Sau đó, các hóa chất được áp dụng. Các phản ứng phân cắt này được thực hiện một cách có kiểm soát và người ta biết được các loại liên kết mà mỗi hóa chất được sử dụng sẽ phá vỡ.

Đọc kết quả

Như trong phương pháp Sanger, việc đọc kết quả liên quan đến việc phân tách theo kích thước của các chuỗi thu được trong hệ thống điện di. Hệ thống bao gồm polyacrylamide cho phép thu được độ phân giải rất thích hợp để đọc gel.

Trình tự hàng loạt

Việc giải trình tự khổng lồ bao gồm một loạt các phương pháp mới, viết tắt là NGS, từ tiếng Anh “Next Generation Sequencing”.

Các phương pháp được phân loại là NGS yêu cầu một bước khuếch đại DNA trước đó (chúng không hoạt động với một phân tử đơn lẻ). Hơn nữa, các nền tảng được sử dụng rất khác nhau. Nguyên tắc của các phương pháp phổ biến nhất sẽ được mô tả dưới đây:

Pyrosequencing

Nó liên quan đến việc theo dõi sự giải phóng pyrophosphat, xảy ra mỗi khi một nucleotide mới được thêm vào sợi DNA. Một hệ thống các enzym được kết hợp với nhau, để sự phát ra ánh sáng (có thể phát hiện được bằng camera) xảy ra mỗi khi một nucleotide mới được kết hợp.

Quá trình bắt đầu bằng việc ủ riêng từng bazơ nitơ để xác minh xem có phát xạ ánh sáng hay không. Pyrosequencing có thể đọc các dải dài, nhưng tỷ lệ lỗi được tìm thấy cao.

Tổng hợp trình tự

Điều này liên quan đến việc kết hợp các nucleotide được dán nhãn. Các thành phần huỳnh quang này được thêm vào, rửa sạch và nucleotide kết hợp được ghi nhận. Sau đó, nhãn nucleotide bị loại bỏ, và quá trình tổng hợp chuỗi có thể tiếp tục. Trong bước tiếp theo, một nucleotide được đánh dấu cũng sẽ được kết hợp và các bước nói trên sẽ được lặp lại.

Một hạn chế của kỹ thuật này xảy ra khi các điểm đánh dấu huỳnh quang không được loại bỏ hoàn toàn. Các khí thải này tạo ra sai số nền, dẫn đến sai số đáng kể.

Giải trình tự thắt

Kỹ thuật này khác với những kỹ thuật khác, vì nó không sử dụng DNA polymerase. Thay vào đó, enzyme quan trọng cho phương pháp này là ligase. Tại đây, các đoạn DNA được đánh dấu huỳnh quang được sử dụng, nó được liên kết bởi enzyme và nó được phát hiện.

Vấn đề lớn nhất với kỹ thuật này là độ dài đoạn ngắn mà nó có thể xử lý.

Giải trình tự Ion Torrent

Kỹ thuật này dựa trên phép đo ion H ⁺ được giải phóng mỗi khi một nucleotide mới được kết hợp. Nguyên tắc này khá giống với pyrosequencing, nhưng rẻ hơn nhiều.

Ví dụ

Trình tự của bộ gen người

Xác định trình tự bộ gen người là một trong những thách thức hứa hẹn nhất trong sinh học, cũng như là một trong những đối thủ được hoan nghênh nhất trong lịch sử khoa học. Trên thực tế, đối với các nhà khoa học tham gia vào dự án, giải trình tự bộ gen đã trở thành một cuộc cạnh tranh.

Năm 1990, ông bắt đầu cái được gọi là "dự án bộ gen người", do nhà khoa học nổi tiếng, người đoạt giải Nobel, James Watson, đứng đầu. Sau một năm, vào năm 1991, Venter nhận thử thách "đánh bại" Watson và giải trình tự bộ gen trước anh ta. Tuy nhiên, vào năm 1992, Watson nghỉ hưu và quyền chỉ huy được thực hiện bởi một nhà nghiên cứu khác.

Năm 1995, Venter công bố thành công của mình trong việc giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ngẫu nhiên. Tương tự như vậy, một năm sau, nhóm đối lập đã công bố trình tự của bộ gen nấm men.

Năm 2000, bằng cấp đã bị chấm dứt. Cả hai công ty đều công bố kết quả sơ bộ về toàn bộ bộ gen của họ trên hai tạp chí khoa học uy tín nhất: Nature và Science.

Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn tiếp tục làm việc để cải thiện các đề xuất, và vào năm 2006, trình tự của một số nhiễm sắc thể người đã được hoàn thành.

Tầm quan trọng và ứng dụng

Biết được thứ tự của các nucleotide của một phân tử quan trọng như DNA có giá trị đối với các nhà sinh học và các chuyên gia liên quan. Chuỗi polynucleotide này chứa tất cả thông tin cần thiết cho sự phát triển và duy trì mọi dạng sống.

Vì những lý do này, kiến ​​thức về trình tự này là cần thiết cho nghiên cứu sinh học. Về cơ bản, xác định trình tự giúp đo lường một trong những đặc tính quan trọng nhất của các hệ thống sinh học và thiết lập sự khác biệt giữa chúng.

Giải trình tự được sử dụng rộng rãi bởi các nhà phân loại học và hệ thống hóa, vì một số trình tự DNA nhất định cho phép thiết lập các tiêu chí để kết luận liệu hai sinh vật có thuộc cùng một loài hay không, ngoài ra có thể đưa ra các giả thuyết về mối quan hệ phát sinh loài giữa chúng.

Ngoài ra, giải trình tự DNA có ứng dụng trong y học và chẩn đoán. Ví dụ, có những hệ thống rẻ tiền và dễ tiếp cận, thông qua giải trình tự, có thể đánh giá xu hướng phát triển một số bệnh (chẳng hạn như ung thư) bằng cách sử dụng cái gọi là đa hình nucleotide đơn (SNP).

Các cuộc điều tra về loại hình tội phạm và pháp y cũng đã được làm phong phú hơn với các kỹ thuật giải trình tự, có thể được sử dụng làm bằng chứng đáng tin cậy về sự tham gia của một cá nhân nhất định vào một tội phạm.

Người giới thiệu

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Trình tự trình tự: lịch sử giải trình tự DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK và Mardis, ER (2013). Cuộc cách mạng giải trình tự thế hệ tiếp theo và tác động của nó đối với hệ gen. Ô, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Sự ganh đua khoa học. Từ Galileo đến dự án bộ gen người. Biên tập Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Giải trình tự DNA bằng chất ức chế kết thúc chuỗi. Kỷ yếu của viện khoa học quốc gia, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Giải trình tự thế hệ tiếp theo biến đổi sinh học ngày nay. Phương pháp bản chất, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Trình tự thế hệ tiếp theo. Caister Academic Press.