KIỂM TRA VOGES-PROSKAUER: NỀN TẢNG, CHUẨN BỊ VÀ SỬ DỤNG - SINH HỌC - 2024

Các Voges-Proskauer thử nghiệm là một thử nghiệm sinh hóa sử dụng để hỗ trợ trong việc xác định các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Nó đặc biệt hữu ích để phân biệt các chủng Escherichia coli với Klebsiella và Enterobacter, trong số những chủng khác.

Thử nghiệm được thực hiện trong môi trường nuôi cấy lỏng có tên Methyl Red - Voges Proskauer, được biết đến nhiều hơn với tên viết tắt là RM / VP. Môi trường này bao gồm polypeptone đệm, glucose, dipotassium phosphate và nước cất.

Môi trường thương mại Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) / VP thử nghiệm tương ứng dương tính và âm tính. Nguồn: Ảnh do tác giả ThS. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, từ Wikimedia Commons

Môi trường RM / VP hiện tại là sự sửa đổi của môi trường Clark và Lubs, môi trường này ban đầu chứa nồng độ pepton và glucose thấp hơn. Do đó, ít ion hydro, cần thiết cho phản ứng Voges-Proskauer dương tính, được tạo ra.

Thử nghiệm dựa trên khả năng vi sinh vật sử dụng glucose thông qua con đường butylene-glycol, và tạo thành sản phẩm cuối cùng trung tính gọi là acetoin, với sự có mặt của oxy và pH kiềm.

Trong môi trường RM / VP, ngoài việc có thể tiết lộ thử nghiệm Voges-Proskauer, thử nghiệm đỏ metyl cũng có thể tiết lộ.

Nền tảng

Cơ sở thử nghiệm Voges-Proskauer

Các pluripepton có trong môi trường cung cấp các nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Về phần mình, glucozơ là hợp chất chính. Nhiều vi khuẩn có khả năng chuyển hóa glucose và tạo thành axit pyruvic.

Axit pyruvic là trung điểm trong quá trình chuyển hóa glucose và từ đó mỗi vi sinh vật có thể thực hiện các con đường khác nhau. Một số sẽ tạo thành các axit hỗn hợp, chẳng hạn như axit lactic, axit axetic, axit formic và axit succinic, và một số khác sẽ tạo thành các sản phẩm trung tính như 2,3-butanediol.

Thử nghiệm Voges-Proskauer cho thấy khả năng của vi sinh vật tạo thành acetyl metyl carbinol (acetoin), một sản phẩm trung gian của 2,3-butanediol trong điều kiện hiếu khí.

Acetoin bị khử và tạo thành 2,3-butanediol, nhưng phản ứng này là thuận nghịch, do đó nếu 2,3-butanediol bị oxy hóa thì acetoin được hình thành. Vì vậy, oxy rất cần thiết.

Dipotassium phosphate là chất đệm đệm hỗn hợp ở pH 6,9 ± 0,2.

Cơ sở giải thích và công bố bằng chứng

Để chứng minh phản ứng, một sự phát triển phải được thực hiện bằng cách sử dụng hai thuốc thử (thuốc thử Barrit), được gọi là Voges A và Voges B.

Voges A là dung dịch 5% của α-naphthol, và Voges B là chế phẩm kali hydroxit 40%. Nếu không có sẵn kali hydroxit, có thể thay thế bằng natri hydroxit 40%.

Α-Naphthol là chất xúc tác sẽ làm tăng cường độ của màu phản ứng, làm cho phép thử nhạy hơn. Trước tiên, phải thêm α-naphthol, lắc ống để môi trường tiếp xúc với oxy. Bằng cách này, acetoin hiện diện được oxy hóa thành diacetyl, và 2,3-butanediol bị oxy hóa để tạo thành acetoin, chuyển thành diacetyl.

Đây là cách α-naphthol sẽ liên kết với diacetyl, chất này đã tham gia vào nhân guanidine có trong axit amin arginine, chất sau đến từ pluripeptone.

Về phần mình, kali hoặc natri hydroxit có nhiệm vụ hấp thụ CO ₂ và phản ứng với pepton. Phản ứng này tạo ra màu hồng cá hồi, có thể nhìn thấy rõ sau khi lắc ống nghiệm rất kỹ.

Phải trộn một lượng chính xác diacetyl, peptone và α-naphthol để màu sắc xuất hiện ngay lập tức. Nếu điều này không xảy ra, ống được phép nghỉ trong 15 phút trước khi thông dịch.

Xét nghiệm thường dương tính sau 2 đến 5 phút, khi có thể thấy màu hồng nhạt. Nếu để yên trong 30 phút đến 1 giờ, cường độ của màu sẽ đạt cực đại (đỏ đậm).

Kết quả âm tính sẽ hiển thị khi nước dùng chuyển sang màu vàng. Sau 1 giờ, nếu kết quả âm tính, màu đồng có thể hình thành do phản ứng của kali hydroxit với α-naphthol.

Sự chuẩn bị

MR / VP trung bình

Cân 17 g môi trường nuôi cấy đã khử nước và hòa tan trong một lít nước cất. Để yên trong 5 phút. Đun sôi cho tan hoàn toàn. Cho 3 đến 4 ml vào ống và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút.

Môi trường nuôi cấy khử nước có màu be và môi trường chuẩn bị có màu hổ phách nhạt.

PH cuối cùng của môi trường là 6,9 ± 0,2.

Thuốc thử Voges A

Cân 5 g α-naphthol và hòa tan trong 50 ml rượu etylic (tuyệt đối). Sau đó tiếp tục thêm rượu etylic đến khi cô cạn còn 100 ml.

Thuốc thử Voges B

Cân 40 g kali hydroxit và hòa tan trong 50 ml nước cất trong cốc. Ly phải được đặt trong chậu nước lạnh để kiểm soát nhiệt độ, vì khi pha chế bị hòa tan, nhiệt độ tăng mạnh.

Sau khi dung dịch nguội, nó được chuyển sang bình định mức và thêm nước cất đến 100 mL.

Quy trình kiểm tra Voges-Proskauer

Để thực hiện thử nghiệm Voges-Proskauer, môi trường RM / VP được cấy vi sinh vật đang nghiên cứu, từ môi trường nuôi cấy tinh khiết trong 18 đến 24 giờ.

Chất cấy không được quá đặc. Nó được ủ ở 35-37 ° C trong 24 đến 48 giờ, mặc dù đôi khi cần ủ trong vài ngày. Cowan và Steel cho rằng 5 ngày là thời gian ủ bệnh tối thiểu cần thiết để phát hiện tất cả các loài Voges-Proskauer (VP) dương tính thuộc họ Enterobacteriaceae.

Phát triển thử nghiệm

Tách phần 1 mL vào một ống và phát triển như sau: Nhỏ 12 giọt (0,6 mL) thuốc thử Voges A và 4 giọt (0,2 mL) Voges B. Trộn để tạo bọt khí và để lắng trong 5 - 10 phút trước khi phiên dịch. Tuy nhiên, nếu que thử vẫn âm tính, hãy để yên và quan sát ống sau 30 phút đến 1 giờ.

Sự xuất hiện của màu đỏ hồng chứng tỏ phản ứng Voges-Proskauer là dương tính. Nếu môi trường vẫn còn màu vàng thì phản ứng là âm tính.

Việc thêm các nhà phát triển theo thứ tự và số lượng được chỉ định là điều cần thiết để tránh phủ định sai.

Sử dụng

Xét nghiệm Voges-Proskauer hữu ích để phân biệt giữa các chủng vi khuẩn E. coli có VP âm tính, thuộc các chi Klebsiella, Enterobacter, Serratia, trong số các chủng khác, có VP dương tính.

Nguồn: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.

QA

Các chủng đối chứng, bao gồm Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium và Enterobacter cloacae ATCC 13047, có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng của môi trường đã chuẩn bị.

Kết quả mong đợi là phản ứng Voges-Proskauer dương tính chỉ đối với K. pneumoniae và E. cloacae. Phần còn lại cho phản ứng tiêu cực.

Người giới thiệu

1. Phòng thí nghiệm Britannia. MR-VP Phương tiện. 2015. Có sẵn tại: www.britanialab.com
2. Phòng thí nghiệm Microkit. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Có sẵn: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Các xét nghiệm sinh hóa để xác định vi khuẩn có tầm quan trọng lâm sàng. Ấn bản thứ 3. Biên tập Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Biên tập Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. Ấn bản thứ 5. Biên tập Panamericana SA Argentina.