VẾT BẨN GIEMSA: CƠ SỞ LÝ LUẬN, VẬT LIỆU, KỸ THUẬT VÀ CÔNG DỤNG - SINH HỌC - 2025

Các Giemsa vết là một loại màu mẫu lâm sàng, dựa trên sự kết hợp giữa thuốc nhuộm axit và cơ bản. Sự sáng tạo của nó được lấy cảm hứng từ công trình được thực hiện bởi Romanowsky, nơi Gustav Giemsa, một nhà hóa học và vi khuẩn học gốc Đức, đã hoàn thiện nó bằng cách thêm glycerol để ổn định các hợp chất.

Những thay đổi được tạo ra đối với kỹ thuật Romanowsky ban đầu cho phép cải thiện đáng kể các quan sát bằng kính hiển vi, do đó kỹ thuật này đã được rửa tội với tên là vết Giemsa.

Các mẫu khác nhau được nhuộm bằng vết Giemsa. A. Trypanosoma evansi ở máu ngoại vi. B. Tế bào máu bình thường. C. Borrelia theileri ở máu ngoại vi. D. U lympho Burkitt.

Vì đây là một kỹ thuật đơn giản để thực hiện, chức năng cao và kinh tế, nó hiện đang được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm lâm sàng để làm lam huyết học, mẫu tủy xương và các phần mô.

Kỹ thuật nhuộm Giemsa rất hữu ích cho các nghiên cứu tế bào học, vì nó cho phép quan sát các cấu trúc tế bào cụ thể. Kỹ thuật này nhuộm tế bào, nhân, nucleoli, không bào và hạt của tế bào, có thể phân biệt ngay cả những vết nhiễm sắc nhỏ.

Hơn nữa, những thay đổi đáng kể về kích thước, hình dạng hoặc màu sắc của hạt nhân có thể được phát hiện, ở đó có thể hình dung sự mất mối quan hệ nhân - tế bào chất.

Mặt khác, nó cho phép xác định các tế bào chưa trưởng thành trong tủy xương và máu ngoại vi, rất quan trọng để chẩn đoán các bệnh nghiêm trọng như bệnh bạch cầu. Nó cũng có thể phát hiện các vi khuẩn hemoparasites, vi khuẩn ngoại bào và nội bào, nấm, trong số những người khác.

Trong di truyền tế bào, nó được sử dụng rộng rãi, vì có thể nghiên cứu quá trình nguyên phân của tế bào.

Cơ sở nhuộm Giemsa

Thuốc nhuộm kiểu Romanowsky dựa trên việc sử dụng sự tương phản giữa thuốc nhuộm có tính axit và bazơ, để nhuộm được các cấu trúc axit và bazơ tương ứng. Như có thể thấy, có ái lực của thuốc nhuộm axit để nhuộm các cấu trúc cơ bản và ngược lại.

Thuốc nhuộm cơ bản được sử dụng là xanh methylen và các dẫn xuất oxy hóa của nó (Azure A và Azure B), trong khi thuốc nhuộm axit là eosin.

Các cấu trúc axit của tế bào là axit nucleic, các hạt của các chất bazơ phân đoạn, trong số các cấu trúc khác, do đó chúng sẽ được nhuộm bằng xanh methylen.

Cũng theo nghĩa này, cấu trúc cơ bản của tế bào là hemoglobin và một số hạt, chẳng hạn như những hạt chứa trong bạch cầu ái toan phân đoạn, trong số những hạt khác; những thứ này sẽ được nhuộm bằng eosin.

Mặt khác, do methylene blue và azure được đặc trưng bởi là chất màu metachromatic, chúng có thể cung cấp một màu sắc thay đổi cho các cấu trúc khác nhau tùy theo tải lượng polyanions mà chúng sở hữu.

Đây là cách kết hợp chiến lược giữa thuốc nhuộm cơ bản và axit để phát triển một phổ màu rộng, theo đặc điểm sinh hóa của từng cấu trúc, đi qua các màu xanh nhạt, xanh đậm, hoa cà và tím trong trường hợp cấu trúc axit.

Trong khi màu do eosin cung cấp ổn định hơn, tạo ra màu giữa đỏ cam và cá hồi.

nguyên vật liệu

Vật liệu để chuẩn bị dung dịch gốc

Chuẩn bị dung dịch gốc cần cân 600 mg vết Giemsa dạng bột, đong 500 cc rượu metylic không chứa axeton và 50 cc glyxerin trung tính.

Cách chuẩn bị dung dịch gốc

Cho bột Giemsa nặng vào cối. Nếu có cục, chúng nên được phun. Sau đó, thêm một lượng đáng kể glycerin đã đo được và trộn thật đều. Hỗn hợp thu được được đổ vào một chai màu hổ phách rất sạch.

Phần còn lại của glyxerin được cho vào cối. Trộn một lần nữa để làm sạch phần còn lại của chất tạo màu bám vào thành cối và đổ vào cùng một lọ.

Đóng nắp chai và đặt trong nồi cách thủy ở 55ºC trong 2 giờ. Trong khi đun cách thủy, lắc nhẹ hỗn hợp sau mỗi nửa giờ hoặc lâu hơn.

Sau đó, hỗn hợp được để nguội để đặt rượu. Trước đó, một phần cồn đo được cho vào cối để rửa hết chất màu còn lại và sau đó nó được thêm vào hỗn hợp cùng với phần cồn còn lại.

Chuẩn bị này nên được để trưởng thành trong ít nhất 2 tuần. Phần dung dịch gốc đã sử dụng phải được lọc.

Để tránh nhiễm bẩn chế phẩm, nên chuyển phần sẽ được sử dụng liên tục vào một chai nhỏ màu hổ phách có ống nhỏ giọt. Đổ đầy lại mỗi khi hết thuốc thử.

Vật liệu để chuẩn bị dung dịch đệm

Mặt khác, dung dịch đệm ở pH 7,2 được chuẩn bị như sau:

6,77 g natri photphat (khan) (NaHPO ₄ ), 2,59 g kali dihyđro photphat (KH ₂ PO ₄ ) và nước cất được cân đến 1000 cc.

Chuẩn bị cuối cùng của chất tạo màu

Để chuẩn bị dung dịch nhuộm cuối cùng, 2 ml dung dịch gốc đã lọc được đo và trộn với 6 ml dung dịch đệm. Khuấy hỗn hợp.

Một thực tế liên quan phải được lưu ý là các kỹ thuật chuẩn bị tạo màu có thể thay đổi tùy thuộc vào công ty thương mại.

Vật liệu bổ sung cần thiết để thực hiện màu

Ngoài các vật liệu được mô tả, bạn phải có cầu tô màu, áo phông có nước hoặc đệm để giặt, các vật liệu trượt hoặc bìa cho vật thể, đồng hồ bấm giờ để kiểm soát thời gian tô màu và giấy thấm hoặc một số vật liệu có thể dùng để làm khô ( gạc hoặc bông).

Kỹ thuật

Quy trình nhuộm

1) Trước khi nhuộm, vết bẩn của mẫu phải sẵn sàng trên phiến kính sạch.

Các mẫu có thể là máu, tủy xương, các phần mô mô học hoặc mẫu âm đạo cổ tử cung. Nên mỏng và để khô 1 hoặc 2 giờ trước khi tô màu.

2) Trên một cây cầu tô màu, đặt tất cả các tờ giấy phải tô màu. Bạn luôn làm việc theo cùng một thứ tự và mỗi trang tính đều được xác định rõ ràng.

3) Nhỏ một vài giọt cồn metyl 100% (metanol) lên vết bôi và để nó tác động trong 3 đến 5 phút, để cố định và khử nước mẫu.

4) Loại bỏ metanol có trên tờ giấy và để khô trong không khí.

5) Sau khi khô, nhỏ dung dịch nhuộm cuối cùng bằng ống nhỏ giọt cho đến khi phủ toàn bộ tờ giấy. Để hành động trong 15 phút. Một số tác giả khuyến nghị lên đến 25 phút. Nó phụ thuộc vào các nhà kinh doanh.

6) Xả vết bẩn và rửa vết bẩn bằng nước cất hoặc bằng dung dịch đệm 7.2.

7) Trên giấy thấm, để các tờ giấy khô ngoài trời, được xếp theo chiều dọc với sự hỗ trợ của giá đỡ.

8) Làm sạch mặt sau của phiến kính bằng tăm bông hoặc tăm bông tẩm cồn để loại bỏ mọi vết bẩn.

Tiện ích

Kỹ thuật nhuộm Giemsa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong số đó: huyết học, nấm học, vi khuẩn học, ký sinh trùng, tế bào học và di truyền tế bào.

Huyết học

Đây là cách sử dụng thường xuyên nhất cho vết bẩn này. Với nó, mỗi tế bào có trong tủy xương hoặc mẫu máu ngoại vi có thể được xác định. Cũng như ước tính số lượng của mỗi loạt, có thể phát hiện tăng bạch cầu hoặc giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, v.v.

Bởi vì nó nhạy cảm trong việc xác định các tế bào chưa trưởng thành, nó có liên quan trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp tính hoặc mãn tính. Cũng có thể chẩn đoán thiếu máu, chẳng hạn như thiếu máu hồng cầu hình liềm, hồng cầu hình liềm, trong số những bệnh khác.

Thần học

Trong lĩnh vực này, việc sử dụng nó phổ biến để tìm kiếm Histoplasma capsulatum (nấm lưỡng hình nội bào) trong các mẫu mô.

Vi khuẩn học

Trên lam huyết học nhuộm Giemsa, có thể phát hiện Borrelias sp ở những bệnh nhân có biểu hiện của bệnh gọi là sốt tái phát. Xoắn khuẩn có rất nhiều trong các hồng cầu, trong các mẫu được lấy vào lúc sốt cao nhất.

Cũng có thể hình dung vi khuẩn nội bào như Rickettsia sp và Chlamydia trachomatis trong tế bào bị nhiễm.

ký sinh trùng

Trong lĩnh vực ký sinh trùng, phương pháp nhuộm Giemsa giúp chẩn đoán được các bệnh ký sinh trùng như sốt rét, bệnh Chagas và bệnh leishmaniasis.

Trong hai giai đoạn đầu, ký sinh trùng Plasmodium sp và Trypanosoma cruzi tương ứng có thể được nhìn thấy trong máu ngoại vi của bệnh nhân nhiễm bệnh, chúng có thể được tìm thấy trong các giai đoạn khác nhau tùy thuộc vào giai đoạn của bệnh.

Để cải thiện việc tìm kiếm ký sinh trùng trong máu, nên dùng thuốc nhuộm Giemsa trộn với thuốc nhuộm May-Grünwald.

Tương tự, bệnh leishmaniasis ở da có thể được chẩn đoán bằng cách đánh giá các mẫu sinh thiết da nhuộm Giemsa nơi tìm thấy ký sinh trùng.

Tế bào học

Phương pháp nhuộm Giemsa cũng được sử dụng để nghiên cứu tế bào học của các mẫu nội mạc cổ tử cung, mặc dù nó không phải là kỹ thuật được sử dụng thường xuyên nhất cho mục đích này.

Nhưng trong những trường hợp khan hiếm tài nguyên, nó có thể được sử dụng, có chức năng tương tự như được cung cấp bởi kỹ thuật Papanicolaou và với chi phí thấp hơn. Tuy nhiên, nó đòi hỏi chuyên môn từ phía giám định viên.

Di truyền tế bào

Một đặc điểm liên quan của phương pháp nhuộm Giemsa là khả năng liên kết mạnh mẽ với các vùng giàu adenin và thymine của DNA. Điều này cho phép DNA được hình dung trong quá trình nguyên phân của tế bào, ở các trạng thái ngưng tụ khác nhau.

Những nghiên cứu này là cần thiết để phát hiện các sai lệch màu sắc như sao chép, mất đoạn hoặc chuyển vị của các vùng khác nhau của nhiễm sắc thể.

Nghiên cứu chứng minh hiệu quả của nhuộm Giemsa

Cannova và cộng sự (2016), đã so sánh 3 kỹ thuật nhuộm để chẩn đoán bệnh leishmaniasis ở da.

Để làm được điều này, họ đã sử dụng các mẫu thu được từ động vật thí nghiệm (Mesocrisetus auratus) được cấy vào Leishmanias.

Các tác giả đã chứng minh rằng vết Giemsa tốt hơn vết Pap-mart® và Gaffney. Do đó, họ coi vết Giemsa là lý tưởng để chẩn đoán bệnh leishmaniasis ở da.

Kết quả tuyệt vời mà các tác giả thu được là do sự kết hợp của thuốc nhuộm tạo nên hỗn hợp Giemsa có đủ các điều kiện cần thiết để tạo ra sự tương phản thuận lợi, cho phép phân biệt rõ ràng cấu trúc của các amastigotes, cả nội bào và ngoại bào.

Các kỹ thuật khác (Pap-mart® và Gaffney) cũng làm được điều đó, nhưng theo cách yếu hơn và do đó khó hình dung hơn. Đó là lý do tại sao nhuộm Giemsa được khuyến cáo để chẩn đoán ký sinh trùng của bệnh leishmaniasis.

Tương tự như vậy, một nghiên cứu của Ramírez và cộng sự (1994) đã đánh giá tính hợp lệ của các vết Giemsa và Lendrum trong phết kết mạc để xác định Chlamydia trachomatis.

Các tác giả xác định rằng các vết Giemsa và Ledrum có độ đặc hiệu ngang nhau, nhưng Giemsa được nhận thấy có độ nhạy cao hơn.

Điều này giải thích tại sao nhuộm Giemsa hiện được sử dụng thường xuyên nhất để chẩn đoán nhiễm khuẩn chlamydia, đặc biệt nếu có ít nguồn tài liệu.

Nguồn: Thuốc thử PanReac Ứng dụng ITW. Vết giemsa. Phiên bản 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Tây Ban Nha.

Khuyến nghị để nhuộm tốt

Không nên đẩy nhanh quá trình làm khô các tấm. Phải dự kiến ​​một khoảng thời gian hợp lý để làm khô nó ngoài trời. Khoảng 2 giờ.

Lên màu ngay sau 2 giờ để có kết quả tốt nhất.

Để vết bẩn cố định và bám màu tốt hơn, mẫu phải được phân bố trên phiến kính sao cho vẫn còn một lớp mỏng và đồng đều.

Mẫu máu được ưu tiên là mao mạch, vì phết tế bào được tạo ra trực tiếp từ giọt máu và do đó mẫu không chứa bất kỳ chất phụ gia nào, giúp duy trì cấu trúc tế bào.

Tuy nhiên, nếu sử dụng máu tĩnh mạch, EDTA nên được sử dụng như một chất chống đông máu chứ không phải heparin, vì heparin thường làm biến dạng tế bào.

Những lỗi thường gặp khi nhuộm Giemsa

Trong thực tế, những sai lầm về màu này có thể được thực hiện. Chúng được chứng minh bằng những thay đổi đột ngột về tông màu của cấu trúc.

Màu cực kỳ xanh

Nó có thể là do:

• Vết bẩn rất dày
• Quá thời gian nhuộm
• Rửa không đủ.
• Sử dụng thuốc thử trên pH trung tính (kiềm).

Trong những điều kiện này, màu sắc của các cấu trúc sau đây bị biến dạng, theo cách mà các hồng cầu thay vì nhuộm màu hồng cá hồi sẽ có màu xanh lục, các hạt của bạch cầu ái toan bị nhuộm màu đỏ gạch sẽ chuyển sang xanh lam hoặc xám và như vậy sẽ có lệch trong các âm thông thường.

Màu hồng quá mức

Nó có thể là do:

• Không đủ thời gian nhuộm.
• Rửa quá lâu hoặc quá nhiều.
• Làm khô xấu.
• Sử dụng thuốc thử có tính axit cao.

Trong trường hợp cụ thể này, các cấu trúc thường nhuộm màu xanh sẽ gần như không nhìn thấy được, trong khi các cấu trúc nhuộm màu hồng sẽ có màu sắc phóng đại rất nhiều.

Ví dụ: Tế bào biểu bì sẽ chuyển sang màu đỏ tươi hoặc màu cam đậm, nhân nhiễm sắc có màu hồng nhạt và các hạt bạch cầu ái toan sẽ có màu đỏ tươi đậm.

Sự hiện diện của kết tủa trong vết bẩn

Nguyên nhân có thể là:

• Sử dụng các màng bẩn hoặc rửa kém.
• Không để vết bẩn khô kỹ.
• Để giải pháp sửa chữa quá lâu.
• Rửa không đầy đủ khi kết thúc nhuộm.
• Lọc không đầy đủ hoặc không lọc chất tạo màu đang được sử dụng.

Sự hiện diện của các hiện vật hình thái

Các hiện vật hình thái có thể xuất hiện dưới dạng vết bẩn, gây khó khăn cho việc hình dung và giải thích các cấu trúc hiện có. Điều này là do:

• Loại thuốc chống đông máu được sử dụng, chẳng hạn như heparin.
• Sử dụng màng bẩn, kém chất lượng hoặc dính dầu mỡ.

Chế độ lưu trữ

Sau khi pha chế, thuốc nhuộm phải được giữ ở nhiệt độ phòng (15 - 25 ° C), tránh để thuốc nhuộm kết tủa. Nó nên được lưu trữ trong một hộp đựng màu hổ phách đóng chặt.

Người giới thiệu

1. Cannova D, Brito E và Simons M. Đánh giá kỹ thuật nhuộm để chẩn đoán bệnh Leishmaniasis ở da. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Thuốc thử PanReac Applicationhem ITW. Vết giemsa. Phiên bản 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Tây Ban Nha.
3. Clark G. Quy trình nhuộm (1981), 4thed. Williams và Willkins.
4. Hóa học lâm sàng ứng dụng. Nhuộm Giemsa để chẩn đoán trong ống nghiệm. Nhà phân phối: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F và Grazioso C. Hiệu lực của các vết Giemsa và Lendrum trong các vết bẩn kết mạc để xác định Chlamydia trachomatis. Bol của Sanit Panam. Năm 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Mycology tổng quát. 1994. Lần xuất bản thứ 2 Đại học Trung tâm Venezuela, Phiên bản Thư viện. Caracas Venezuela.
7. "Vết giemsa." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 1 tháng 9 năm 2017, 01:02 giờ UTC. Ngày 6 tháng 12 năm 2018, es.wikipedia.org.