NHUỘM GRAM: CƠ SỞ LÝ LUẬN, VẬT LIỆU, KỸ THUẬT VÀ CÔNG DỤNG - SINH HỌC - 2026

Các Nhuộm Gram là đơn giản nhất và hữu ích nhất nhuộm kỹ thuật trong vi sinh học chẩn đoán. Kỹ thuật này được tạo ra bởi bác sĩ Đan Mạch Hans Christian Gram vào năm 1884, người đã quản lý để phân loại vi khuẩn là Gram dương và Gram âm, theo thành phần của thành tế bào.

Kỹ thuật này đã trải qua một số sửa đổi nhất định của Hucker vào năm 1921 để ổn định thuốc thử và cải thiện chất lượng của màu nhuộm, đó là lý do tại sao nhuộm Gram còn được gọi là Gram-Hucker.

Các vết bẩn khác nhau được nhuộm Gram. A. Cầu khuẩn gram dương. B. Thanh Gram âm. C. Trực khuẩn gram dương, đa nhân và đơn nhân. D. Nấm men.

Với kỹ thuật này, người ta cũng có thể quan sát hình dạng của vi sinh vật, đó là, nếu chúng là cầu khuẩn, trực khuẩn, coccobacilli, đa nhân, dạng sợi, và những loại khác. Cũng như sự phân bố của nó trong không gian: trong một cụm, trong chuỗi, cô lập, theo cặp, trong tứ phân, v.v.

Khi nghi ngờ nhiễm vi khuẩn, hầu hết các mẫu nhận được phải được phết lên phiến kính và nhuộm Gram để kiểm tra bằng kính hiển vi.

Báo cáo Gram sẽ hướng dẫn bác sĩ về loại vi sinh vật nào có thể là nguyên nhân gây nhiễm trùng, trước khi có kết quả nuôi cấy cuối cùng.

Trong một số trường hợp, tính mạng của bệnh nhân bị tổn hại rất lớn, do đó các bác sĩ cần báo cáo Gram gấp để tiến hành điều trị theo kinh nghiệm, trong khi chờ xác định vi sinh vật.

Ví dụ, nếu Gram cho thấy có cầu khuẩn Gram dương trong dịch não tủy, bác sĩ sẽ hướng dẫn liệu pháp ban đầu bằng thuốc kháng sinh để loại bỏ loại vi khuẩn này, theo các quy trình được thiết lập cho điều này.

Sau khi có kết quả cuối cùng với tên của vi sinh vật được phân lập và kháng sinh đồ tương ứng của nó, bác sĩ sẽ đánh giá xem có nên thay đổi liệu pháp hay không. Quyết định này sẽ được thực hiện dựa trên nghiên cứu về tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh mà anh ta đang nhận và sự tiến triển của bệnh nhân.

Nền tảng

Đây là một kỹ thuật có 4 bước cơ bản: nhuộm màu, cố định với chất nhuộm màu, đổi màu và phủ màu. Do đó, kỹ thuật này, ngoài việc tạo màu cho vi khuẩn, còn cho phép phân biệt chúng.

Crystal violet là chất tạo màu đầu tiên được sử dụng. Nó có ái lực với peptidoglycan và sẽ nhuộm tất cả các vi khuẩn có màu tím, sau đó lugol được đặt vào, hoạt động như một chất bám màu, tức là nó sẽ tạo ra các phức tinh thể tím-iot không hòa tan - các protein ribonuclear trong tế bào. .

Vi khuẩn Gram dương, có thành peptidoglycan dày, tạo thành nhiều phức hợp hơn (tinh thể tím-iốt), do đó chúng giữ được thuốc nhuộm.

Ngoài ra, nó cũng ảnh hưởng là thành vi khuẩn Gram dương chứa một lượng lớn các axit không bão hòa, thể hiện ái lực lớn với các chất oxy hóa (Lugol).

Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglycan mỏng, khiến vi khuẩn ít hình thành phức hợp hơn vi khuẩn Gram dương.

Sau đó đến bước đổi màu, nơi vi khuẩn Gram dương và Gram âm hoạt động khác nhau.

Vi khuẩn gram âm có màng ngoài giàu lipopolysaccharid, là một phần của thành tế bào của chúng. Chất béo bị phá hủy khi tiếp xúc với cồn axeton, do đó màng ngoài trở nên mất ổn định, giải phóng tinh thể màu tím.

Đây là cách nó được phản công bằng safranin hoặc fuchsin cơ bản, chuyển sang màu đỏ.

Trong trường hợp vi khuẩn Gram dương, chúng chống lại sự phai màu vì thuốc tẩy hoạt động bằng cách đóng các lỗ chân lông, ngăn không cho phức hợp tinh thể tím / iốt rò rỉ ra ngoài.

Do đó, màu với màu tím pha lê vẫn ổn định và không có chỗ cho safranin hoặc fuchsin. Đây là lý do tại sao những vi khuẩn này nhuộm màu xanh đậm hoặc tím.

nguyên vật liệu

Bộ nhuộm của Gram bao gồm:

• Kính màu tím
• Lugol
• Rượu axeton
• Safranin hoặc fuchsin cơ bản

Chuẩn bị thuốc nhuộm và thuốc thử

Dung dịch tím pha lê

Giải pháp cho:

Tinh thể màu tím ------------- 2 gr

Cồn etylic 95% ----------- 20cc

Giải pháp B:

Amoni oxalat ----------- 0,8 gr

Nước cất ------------- 80 cc

Để pha chế thuốc tím tinh thể lần cuối, dung dịch A phải được pha loãng 1:10 với nước cất và trộn với 4 phần dung dịch B. Hỗn hợp này được bảo quản trong 24 giờ trước khi sử dụng. Lọc vào lọ nhuộm màu hổ phách bằng giấy lọc.

Số lượng cần dùng hàng ngày được chuyển vào chai nhỏ giọt màu hổ phách.

Iodo-Lugol

Cân và đo lượng chỉ định của mỗi hợp chất, như sau:

Tinh thể iốt ------------- 1gr

Kali iotua ------------- 2gr

Nước cất ------------- 300 cc

Kali iotua hòa tan từng ít một trong nước và sau đó iot được thêm vào. Dung dịch được cạo vào chai màu hổ phách.

Số lượng cần sử dụng hàng ngày được chuyển sang một chai màu hổ phách nhỏ hơn có ống nhỏ giọt.

Tẩy trắng

Cồn Ethyl 95% -----------– 50 ml

Axeton ------------------ 50 ml

Nó được chuẩn bị trong các phần bằng nhau. Đậy kỹ, vì nó có xu hướng bay hơi.

Cho vào lọ nhỏ giọt.

Chế phẩm này giúp đổi màu trong thời gian vừa phải 5-10 giây và được khuyến khích nhất.

Những người mới bắt đầu chỉ thích sử dụng cồn etylic 95%, khi độ phai màu chậm hơn từ 10 đến 30 giây.

Trong khi những người có kinh nghiệm hơn có thể sử dụng axeton nguyên chất, nơi sự đổi màu xảy ra rất nhanh từ 1 đến 5 giây.

Tương phản

Giải pháp chứng khoán Safranin

Safranina -------------– 2,5 gr

Cồn etylic 95% --------– 100 cc

Sau khi cân lượng safranin chỉ định, nó được hòa tan trong 100 ml cồn etylic 95%.

Dung dịch safranin làm việc được chuẩn bị từ dung dịch gốc.

Để thực hiện việc này, đong 10 cc dung dịch gốc, thêm 90 cc nước cất để tạo thành 100 ml.

Nên chuyển lượng cần dùng hàng ngày sang chai màu hổ phách có ống nhỏ giọt.

Các vi sinh vật nhuộm Gram âm yếu với vết Gram-Hucker, chẳng hạn như một số vi khuẩn kỵ khí nhất định, Legionella sp, Campylobacter sp, và Brucella sp, có thể được nhuộm tốt hơn nhiều bằng cách sử dụng phương pháp điều chỉnh vết Gram-Hucker của Kopeloff, gọi là vết Gram-Kopeloff.

Kỹ thuật này thay đổi thuốc nhuộm safranin thành fuchsin cơ bản. Với sự thay đổi này có thể tạo màu hiệu quả cho các vi sinh vật nói trên.

Bảo quản thuốc thử

Chất tạo màu đã pha nên được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Chuẩn bị vết bẩn của mẫu để có màu

Một mẫu phải chứa ít nhất 10 ⁵ vi sinh vật trước khi có thể quan sát thấy vi sinh vật đó trong vết bẩn. Các vết bẩn có thể được tạo ra từ mẫu trực tiếp hoặc từ các mẫu cấy trong môi trường rắn hoặc lỏng.

Các vết bẩn phải đồng đều, phân bố tốt và không quá dày để có thể hình dung rõ hơn các cấu trúc hiện có.

-Gram mẫu trực tiếp

Gram nước tiểu không ly tâm

Nước tiểu được trộn đều và 10 µl được đặt trên một phiến kính. Việc quan sát ít nhất một vi khuẩn / trường Dip cho thấy có nhiễm trùng.

Điều này có nghĩa là mẫu cấy sẽ có khoảng hơn 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) nước tiểu trong 85% trường hợp.

Phương pháp này không hữu ích cho số lượng khuẩn lạc dưới 100.000 CFU.

CSF Gram

Dịch não tủy phải được ly tâm, loại bỏ phần nổi phía trên, và viên nén được trải trên một phiến kính. Chất lỏng này vô trùng trong điều kiện bình thường; quan sát vi khuẩn cho thấy nhiễm trùng.

Gram mẫu hô hấp

Gram dịch rửa phế quản đờm, phế quản hoặc phế quản, mặc dù có thể có nhiều loại vi sinh vật, sẽ luôn hướng dẫn chẩn đoán, ngoài việc hữu ích với loại tế bào quan sát được.

Trong trường hợp có đờm, cần chuẩn bị phết tế bào với những phần mẫu có nhiều mủ nhất.

Gam phân

Không nên thực hiện Gram trên loại mẫu này, vì nó không có giá trị chẩn đoán.

-Gram cây trồng

Chúng có thể được thực hiện theo hai cách, một từ nền văn hóa lỏng và cách khác từ nền văn hóa rắn.

Nền văn hóa lỏng

Từ các nền văn hóa lỏng, nó cực kỳ đơn giản; Một số rang của nước dùng vẩn đục được thực hiện dưới lò đốt và đặt trên một tấm trượt sạch và khô, thực hiện chuyển động tròn từ trung tâm ra ngoại vi, để phân phối nguyên liệu đồng đều.

Để nó tự khô trong không khí. Sau khi khô, vật liệu được cố định vào tấm bằng nhiệt. Để làm điều này, với sự trợ giúp của một cái nhíp, tấm được đưa qua ngọn lửa của lò đốt Bunsen từ 3 đến 4 lần, cẩn thận để không làm cháy vật liệu.

Tấm được để nguội và được đặt trên cầu tô màu.

Cây trồng rắn

Để thực hiện phết tế bào nhuộm Gram từ môi trường nuôi cấy đặc, tiến hành như sau:

Trước khi chọn khuẩn lạc cần lấy, cần chuẩn bị phiến kính, nhỏ khoảng hai giọt dung dịch nước muối sinh lý vô trùng.

Nếu đĩa nuôi cấy ban đầu chứa nhiều loại khuẩn lạc khác nhau, thì một khuẩn lạc riêng biệt của mỗi loại sẽ được chọn để thực hiện Gram. Mỗi khuẩn lạc sẽ được lấy vòng platin để hòa tan trong dung dịch muối đã đặt trước đó trên phiến kính.

Các chuyển động tròn được thực hiện từ trung tâm hướng ra ngoại vi, để phân bố đồng nhất khuẩn lạc trên trang chiếu.

Để nó tự khô trong không khí. Sau khi khô, tấm được cố định bằng nhiệt, như đã giải thích trước đây (bằng cách đốt cháy tấm trượt với bật lửa), cẩn thận để không làm cháy vật liệu.

Quy trình này phải được thực hiện với từng loại khuẩn lạc khác nhau. Trên một mảnh giấy, thứ tự của những gì được quan sát nên được ghi chú, ví dụ:

Khuẩn lạc 1: Khuẩn lạc màu vàng tan huyết beta: Các cầu khuẩn gram dương được quan sát thành từng đám

Khuẩn lạc 2: Khuẩn lạc màu kem, không tan máu: Quan sát thấy coccobacilli Gram âm.

Mỗi slide phải được dán nhãn để biết những gì chúng ta đang quan sát.

Kỹ thuật

Kỹ thuật nhuộm Gram cực kỳ dễ thực hiện và tương đối rẻ tiền và không thể thiếu trong phòng thí nghiệm vi sinh.

Nó được thực hiện như sau:

1. Cố định vết bẩn bằng nhiệt và đặt lên cầu nhuộm.
2. Dùng thuốc tím pha lê che phủ hoàn toàn phiến kính trong 1 phút.
3. Rửa sạch bằng nước Không khô
4. Đậy tấm bằng dung dịch lugol, để yên trong 1 phút. Rửa sạch bằng nước Đừng làm khô.
5. Tẩy trong 5-10 giây bằng cách lắc nhẹ trong cồn axeton. Hoặc, đặt tờ giấy ở vị trí thẳng đứng và nhỏ từng giọt chất khử màu lên bề mặt cho đến khi loại bỏ hết lượng thủy tinh tím không dính. Đừng vượt quá.
6. Rửa sạch bằng nước Đừng làm khô.
7. Thay nắp trượt trên cầu nhuộm và đậy nắp trong 30 giây bằng safranin (Gram-Hucker) hoặc 1 phút bằng fuchsin cơ bản (Gram-Kopeloff).
8. Rửa bằng nước
9. Để nó tự khô trong không khí ở tư thế thẳng đứng.

Khi đã khô, nhỏ 1 giọt dầu ngâm để quan sát dưới vật kính 100X trong kính hiển vi ánh sáng.

Tiện ích

Kỹ thuật này cho phép phân biệt sự khác nhau về hình thái của hầu hết các vi khuẩn.

Men cũng được phân biệt bằng màu sắc này. Họ lấy màu tím pha lê, tức là họ nhuộm Gram dương.

Mặt khác, có thể phân biệt trực khuẩn Gram dương hình thành bào tử, trong đó có thể quan sát thấy một không gian rõ ràng bên trong trực khuẩn, nơi nội bào tử hình thành, mặc dù bào tử không bắt màu tốt. Các kỹ thuật khác như Shaeffer-Fulton được sử dụng để nhuộm bào tử.

Cần lưu ý rằng loại thuốc nhuộm này không dùng để nhuộm màu cho tất cả các loại vi khuẩn, tức là có những trường hợp thuốc nhuộm không có tác dụng.

Trong trường hợp này có thể kể đến vi khuẩn thiếu thành tế bào. Ví dụ: chi Mycoplasma, tế bào hình cầu, ureaplasma, dạng L và nguyên sinh chất.

Nó cũng làm ố các vi khuẩn rất nặng có thành chứa nhiều axit mycolic, chẳng hạn như Mycobacteria, và vi khuẩn nội bào như Chlamydias và Rickettsias.

Nó cũng không hiệu quả trong việc nhuộm hầu hết các vi khuẩn xoắn khuẩn.

Có những vi khuẩn thuộc cùng một giống có thể được quan sát trong cùng một mẫu là Gram dương và Gram âm. Khi điều này xảy ra, nó được gọi là vết Gram biến đổi, có thể do sự thay đổi chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH hoặc nồng độ chất điện giải.

Lỗi thường gặp

Tẩy trắng quá mức

Sự phóng đại trong bước đổi màu có thể dẫn đến việc quan sát thấy các vi sinh vật Gram âm giả.

Không phải đợi thời gian khô đủ lâu để thêm dầu ngâm vào

Nó có thể làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm Gram âm (Gram âm giả). Điều này xảy ra bởi vì trong môi trường nuôi cấy cũ có khả năng vi khuẩn đã chết hoặc bị hư hỏng và trong những điều kiện này, vi khuẩn không giữ được màu tím pha lê.

Sử dụng dung dịch lugol rất cũ:

Theo thời gian, lugol mất đi các đặc tính và màu sắc của nó mờ dần. Nếu thuốc thử đã bị biến chất được sử dụng, nó sẽ không cố định tinh thể tím tốt, do đó có khả năng thu được hình ảnh vi sinh vật Gram âm sai.

Nền xanh

Nền được đổi màu thích hợp sẽ có màu đỏ. Nền màu xanh lam cho thấy sự đổi màu không đủ.

Người giới thiệu

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Vi sinh y tế, ấn bản thứ 6 McGraw-Hill, New York, Hoa Kỳ
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Xuất bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Biên tập Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Thần học chung. Lần xuất bản thứ 2 Đại học Trung tâm Venezuela, Phiên bản Thư viện. Caracas Venezuela.
5. "Nhuộm Gram." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Ngày 4 tháng 10 năm 2018, 23:40 giờ UTC. Ngày 9 tháng 12 năm 2018, 17:11. Lấy từ es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Sách hướng dẫn về vi sinh y tế. Ấn bản lần 2, Venezuela: Tổng cục truyền thông và ấn phẩm của Đại học Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Vết bẩn cơ bản trong phòng thí nghiệm vi sinh. Nghiên cứu về người khuyết tật. 2014; 3 (1): 10-18.