NHUỘM KINYOUN: CƠ SỞ VÀ KỸ THUẬT - SINH HỌC - 2026

Các Kinyoun nhuộm là một kỹ thuật nhuộm sử dụng để vi khuẩn và ký sinh trùng vết rượu axit kháng. Nó được sinh ra từ việc sửa đổi màu sắc Ziehl-Neelsen; Cả hai kỹ thuật được giải thích theo cách giống nhau nhưng khác nhau ở hai yếu tố: trong việc chuẩn bị thuốc thử chính và kỹ thuật Kinyoun không sử dụng nhiệt.

Vì lý do này, nó còn được gọi là vết lạnh Ziehl-Neelsen hoặc Kinyoun biến tính lạnh. Nó được chỉ định để nhuộm Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, mycobacteria không điển hình, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris và Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum nhuộm bằng vết Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, từ Wikimedia Commons

Cần lưu ý rằng Nocardia nhuộm yếu bằng kỹ thuật này vì chúng có khả năng kháng axit-cồn một phần, vì vậy đối với chi này, có một sự thay đổi phương pháp luận.

Đổi lại, kỹ thuật Kinyoun lạnh đã được kết hợp với kỹ thuật trichrome được Didier sửa đổi để phát hiện cầu trùng (Cryptosporidium parvum và Isospora belli) và bào tử microsporidia (Enterocytozoon bieneusi và Encephalitozoon gutis).

Nền tảng

Thuốc thử nhuộm màu chính là carbolfuchsin hoặc carbol fuchsin, có đặc tính liên kết với axit carbolic tồn tại trong thành tế bào sáp giàu lipid (axit mycolic) của vi khuẩn mycobacteria và một số ký sinh trùng nhất định.

Liên kết này không bị chống lại bởi chất tẩy axit; do đó, vi sinh vật được định nghĩa là nhanh axit.

Không giống như kỹ thuật Ziehl-Neelsen - cố định thuốc nhuộm thông qua nhiệt-, trong kỹ thuật Kinyoun, bước này không cần thiết, vì dung dịch carbolic fuchsin được chuẩn bị cho kỹ thuật này chứa nồng độ phenol cao.

Phenol hòa tan vật liệu lipid trong thành tế bào, cho phép thuốc nhuộm carbolfuchsin đi vào. Sau khi thuốc nhuộm thẩm thấu, nó vẫn cố định mặc dù rửa bằng cồn axit.

Bằng cách này, các vi sinh vật nhanh axit có màu đỏ đặc trưng, ​​trong khi mọi thứ không nhanh axit sẽ bị biến màu và ngả sang màu xanh lam.

Kỹ thuật

nguyên vật liệu

- Carbol fuchsin biến tính.

- Rượu-acid.

- Xanh metylen.

Chuẩn bị Kinyoun carbol fuchsin

- Fuchsin cơ bản: 4 gr.

- Phenol: 8 ml.

- Cồn (95%): 20 ml.

- Nước cất: 100 ml.

Fuchsin cơ bản nên được hòa tan từ từ trong rượu, trộn liên tục. Sau đó, phenol kết tinh được nấu chảy trong nồi cách thủy ở 56 ° C. Sau khi hòa tan, 8 ml được thêm vào dung dịch fuchsin đã chuẩn bị ở trên.

Điều chế axit-rượu

- Axit clohydric đặc: 3 ml.

- Etanol (95%): 97 ml.

Nó phải được đo, nối và trộn.

Chuẩn bị thuốc nhuộm tương phản xanh methylen

- Xanh metylen: 0,3 g.

- Nước cất: 100 ml.

Nó được cân và hòa tan.

Kỹ thuật nhuộm Kinyoun

1- Chuẩn bị phết tế bào trực tiếp từ mẫu, có thể là đờm, dịch phổi, cặn lắng trong nước tiểu, dịch não tủy hoặc phân, trong số những chất khác; hoặc từ huyền phù vi sinh vật thu được từ các khuẩn lạc thuần khiết phát triển trong môi trường nuôi cấy sơ cấp.

2- Sửa chữa vết bẩn bằng nhiệt.

3- Đặt vết bẩn lên cầu nhuộm và phủ bằng thuốc thử Kinyoun carbol fuchsin đã chuẩn bị. Để nó nghỉ từ 3 đến 5 phút.

4- Rửa bằng nước cất.

5- Tẩy bằng cồn có tính axit trong 3 phút và rửa lại bằng nước cất.

6- Tẩy lại bằng cồn axit trong 1 hoặc 2 phút cho đến khi không còn màu nữa.

7- Rửa bằng nước cất và để ráo nước, đặt lam kính thẳng đứng.

8- Che chế phẩm bằng xanh methylen và để yên trong 4 phút.

9- Rửa bằng nước cất và để khô ngoài không khí.

10- Kiểm tra ở 40X và sau đó ở 100X.

Để cải thiện và tăng tốc độ nhuộm màu của vi sinh vật nhanh bằng axit, hãy thêm 1 giọt chất làm ướt (như Tergitol số 7) vào 30 đến 40 ml Kinyoun Carbol Fuchsin.

Một số phòng thí nghiệm thay đổi thuốc nhuộm tương phản xanh methylen thành xanh lục sáng hoặc axit picric; đầu tiên tạo ra màu xanh lá cây cho nền và thứ hai tạo ra màu vàng.

Kỹ thuật Kinyoun đặc biệt cho Nocardias

Để cải thiện khả năng nhuộm màu của vi khuẩn thuộc giống Nocardia, người ta sử dụng phương pháp điều chỉnh màu nhuộm Kinyoun. Kỹ thuật như sau:

1- Che vết bẩn bằng Kinyoun carbol fuchsin trong 3 phút.

2- Rửa bằng nước cất.

3- Làm mất màu nhanh bằng cồn axit pha sẵn 3% cho đến khi không còn màu nữa.

4- Rửa lại bằng nước cất.

5- Che chế phẩm bằng xanh methylen và để nó tác dụng trong 30 giây.

6- Rửa bằng nước cất và để khô ngoài không khí.

Kỹ thuật carbol fuchsin và trichrome kết hợp được Didier sửa đổi

Kỹ thuật này được khuyến nghị để phân tích các mẫu phân tìm bào tử coccidia và Microsporidium cùng một lúc. Quy trình cần thực hiện như sau:

1- Che vết bẩn bằng Kinyoun carbol fuchsin trong 10 phút.

2- Loại bỏ chất màu và rửa bằng nước cất.

3- Tẩy trong 30 giây bằng cồn axit clohydric.

4- Rửa lại bằng nước cất.

5- Che vết bẩn bằng dung dịch trichrome trong 30 phút ở 37 ° C.

6- Rửa bằng nước cất.

7- Tẩy trắng trong 10 giây bằng rượu axit axetic.

8- Rửa vết bẩn trong 30 giây bằng etanol 95%.

QA

Là một đối chứng dương tính, các mẫu phết với các chủng vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis được chuẩn bị và nhuộm bằng thuốc thử đã chuẩn bị để xác minh rằng vi khuẩn có màu sắc thích hợp (đỏ-fuchsia).

Các đối chứng âm tính cũng có thể được sử dụng bằng cách chuẩn bị vết bẩn với bất kỳ chủng nào khác ngoài cồn axit nhanh, do đó xác minh rằng toàn bộ mẫu có màu tương phản.

Kỹ thuật Kinyoun so với kỹ thuật Ziehl-Neelsen

Kỹ thuật Kinyoun đơn giản hơn vì loại bỏ được bước gia nhiệt, nhưng ưu điểm chính của nó là tránh phát ra hơi, rất độc và gây ung thư về lâu dài. Do đó, vết Kinyoun an toàn hơn cho nhân viên nhuộm.

Điều quan trọng cần lưu ý là phải cẩn thận để thuốc thử không tiếp xúc trực tiếp với da vì chúng có tính ăn mòn và chất tẩy trắng dễ cháy.

Đối với những bất lợi, một phết tế bào âm tính không nhất thiết chỉ ra rằng sinh vật không có mặt. Hơn nữa, sự hiện diện của các mảnh vụn tế bào có thể dẫn đến dương tính giả, dẫn đến sự nhầm lẫn trong chẩn đoán.

Tài liệu tham khảo

1. Hóa học lâm sàng ứng dụng. (2016). BK Kinyoun Kit. Có sẵn tại: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Vết Kinyoun và hai con Coccidia trong HIV. Tạp chí Y học MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Chẩn đoán vi sinh Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Biên tập Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Chẩn đoán vi sinh. (Xuất bản lần thứ 5). Argentina, Biên tập Panamericana SA
5. Những người đóng góp Wikipedia. "Vết bẩn Kinyoun." Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí. Wikipedia, Bách khoa toàn thư miễn phí, ngày 8 tháng 2 năm 2018. Web. Ngày 5 tháng 1 năm 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Thực hiện kỹ thuật nhuộm để chẩn đoán đồng thời Coccidia và Microsporidia. Viện Vệ sinh thuộc Đại học Cộng hòa. Montevideo. Uruguay. Có tại: Hygiene.edu.uy