VẾT ZIEHL-NEELSEN: CƠ SỞ LÝ LUẬN, THUỐC THỬ VÀ KỸ THUẬT - SINH HỌC - 2026

Các Ziehl-Neelsen một kỹ thuật tô màu để xác định vi sinh vật axit rượu kháng (ARA). Tên của quy trình vi sinh này đề cập đến các tác giả của nó: nhà vi khuẩn học Franz Ziehl và nhà bệnh học Friedrich Neelsen.

Kỹ thuật này là một loại nhuộm phân biệt, ngụ ý sử dụng các loại thuốc nhuộm khác nhau để tạo ra sự tương phản giữa các cấu trúc mà bạn muốn quan sát, phân biệt và xác định sau này. Nhuộm Ziehl-Neelsen được sử dụng để xác định một số loại vi sinh vật.

Vết Ziehl-Neelsen

Một số sinh vật này là vi khuẩn mycobacteria (ví dụ: Mycobacterium tuberculosis), nocardia (ví dụ, Nocardia sp.), Và một số ký sinh trùng đơn bào (ví dụ, Cryptosporidium parvum). Nhiều vi khuẩn có thể được phân loại thông qua một kỹ thuật phổ biến gọi là nhuộm Gram.

Tuy nhiên, một số nhóm vi khuẩn yêu cầu các phương pháp khác để có thể xác định chúng. Các kỹ thuật như nhuộm Ziehl-Neelsen đòi hỏi sự kết hợp của thuốc nhuộm với nhiệt để cố định chất nhuộm trước vào thành tế bào.

Sau đó là một quá trình tẩy trắng cho phép tạo ra hai kết quả: kháng hoặc nhạy cảm với sự đổi màu của axit và rượu.

Nền tảng

Cơ sở lý luận của kỹ thuật nhuộm này dựa trên các đặc tính của thành tế bào của các vi sinh vật này. Thành được tạo thành từ một loại axit béo gọi là axit mycolic; Chúng có đặc điểm là có chuỗi rất dài.

Khi axit béo có cấu trúc rất dài, chúng có thể giữ thuốc nhuộm dễ dàng hơn. Một số chi vi khuẩn rất khó nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram, do hàm lượng axit mycolic cao trong thành tế bào.

Vết Ziehl-Neelsen sử dụng hợp chất phenolic carbol fuchsin, một vết bẩn cơ bản. Chất này có khả năng tương tác với các axit béo của thành tế bào, có kết cấu dạng sáp ở nhiệt độ phòng.

Khả năng nhuộm màu carbol fuchsin được tăng cường khi có nhiệt, khi sáp nóng chảy và các phân tử thuốc nhuộm di chuyển nhanh hơn vào thành tế bào.

Axit được sử dụng sau này dùng để đổi màu các tế bào không bị nhuộm màu vì thành của chúng không liên quan đủ đến thuốc nhuộm; do đó, sức mạnh của thuốc tẩy axit là có thể loại bỏ thuốc nhuộm axit. Các tế bào chống lại sự đổi màu này được gọi là axit nhanh.

Chất tạo màu phụ

Sau khi khử màu của mẫu, nó được đối chiếu với một loại thuốc nhuộm khác được gọi là thuốc nhuộm thứ cấp. Nói chung, xanh methylen hoặc xanh malachit được sử dụng.

Thuốc nhuộm thứ cấp làm bẩn vật liệu nền và do đó tạo ra sự tương phản với các cấu trúc đã được nhuộm ở bước đầu tiên. Chỉ những tế bào bị đổi màu mới hấp thụ thuốc nhuộm thứ hai (chất nhuộm màu) và tiếp nhận màu của chúng, trong khi những tế bào nhanh bằng axit vẫn giữ được màu đỏ.

Quy trình này thường được sử dụng để xác định Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium leprae, được gọi là trực khuẩn axit nhanh.

Thuốc thử

Chất tạo màu chính

0,3% carbol fuchsin (đã lọc) được sử dụng. Thuốc nhuộm này được điều chế từ hỗn hợp rượu: phenol trong etanol (90%) hoặc metanol (95%), và trong hỗn hợp này có 3 gam fuchsin cơ bản được hòa tan.

Dung dịch tẩy trắng

Trong bước này, có thể sử dụng dung dịch axit cồn 3% hoặc axit sunfuric 25%.

Thuốc nhuộm thứ cấp (thuốc nhuộm phản ứng)

Thuốc nhuộm được sử dụng nhiều nhất để tương phản các mẫu thường là xanh metylen 0,3%. Tuy nhiên, cũng có thể sử dụng các loại khác, chẳng hạn như xanh malachit 0,5%.

Kỹ thuật

Quy trình nhuộm nhanh bằng axit

Chuẩn bị phết tế bào vi khuẩn

Chuẩn bị này được thực hiện trên phiến kính khô, sạch, tuân theo các biện pháp phòng ngừa vô trùng.

Sấy khô

Để vết bẩn khô ở nhiệt độ phòng.

Làm nóng mẫu

Mẫu phải được làm nóng bằng cách châm lửa vào phiến kính bên dưới. Cố định cồn có thể được thực hiện khi vết bẩn chưa được làm sạch đờm (xử lý bằng natri hypoclorit để làm trắng) và nếu vết bẩn không bị ố ngay lập tức.

M. tuberculosis được loại bỏ bằng thuốc tẩy và trong quá trình nhuộm. Sự cố định bằng nhiệt của đờm không được điều trị sẽ không giết được M. tuberculosis, trong khi cố định bằng cồn có tác dụng diệt khuẩn.

Che vết bẩn

Vết bẩn được bao phủ bởi dung dịch carbol fuchsin (vết bẩn cơ bản chính).

Làm nóng vết bẩn

Điều này được thực hiện trong 5 phút. Bạn sẽ nhận thấy sự phát triển của hơi nước (khoảng 60 ° C). Điều quan trọng là không để quá nóng và tránh làm cháy mẫu.

Liên quan đến việc làm nóng vết bẩn, cần hết sức cẩn thận khi đun nóng carbol fuchsin, đặc biệt nếu quá trình nhuộm được tiến hành trên khay hoặc vật chứa khác trong đó các hóa chất dễ cháy từ lần nhuộm trước đã được thu gom.

Chỉ nên đặt ngọn lửa nhỏ dưới các phiến kính bằng cách sử dụng một miếng gạc đã được thắp sáng trước đó được làm ẩm với một vài giọt rượu axit, metanol hoặc etanol 70%. Tránh sử dụng một miếng gạc lớn ngâm trong etanol vì đây là một nguy cơ hỏa hoạn.

Rửa vết bẩn

Việc rửa này phải được thực hiện bằng nước sạch. Nếu nước máy không sạch, tốt nhất là rửa vết bẩn bằng nước lọc hoặc nước cất.

Che vết bẩn bằng cồn axit

Rượu axit này phải ở mức 3%. Việc che phủ được thực hiện trong 5 phút hoặc cho đến khi vết bẩn đủ đổi màu, tức là có màu hồng nhạt.

Cần phải lưu ý rằng rượu có tính axit dễ cháy; do đó, nó phải được sử dụng hết sức cẩn thận. Tránh ở gần các nguồn bắt lửa.

Rửa vết bẩn

Rửa phải bằng nước cất sạch.

Che vết bẩn bằng vết bẩn

Nó có thể là vết màu xanh malachit (0,5%) hoặc xanh methylen (0,3%) trong 1 đến 2 phút, sử dụng thời gian lâu hơn nếu vết bẩn mỏng.

Rửa vết bẩn

Một lần nữa nên sử dụng nước sạch (cất).

Để thoát

Mặt sau của slide nên được lau sạch và đặt vết bẩn lên giá thoát nước để cho khô thoáng (không dùng giấy thấm để làm khô).

Kiểm tra vết bẩn dưới kính hiển vi

Vật kính 100X và dầu ngâm phải được sử dụng. Quét vết bẩn một cách có hệ thống và ghi lại các quan sát thích hợp.

Giải thích kết quả

Về mặt lý thuyết, các vi sinh vật nhuộm màu hơi đỏ được coi là dương tính với axit (AAR +).

Ngược lại, nếu vi sinh vật nhuộm màu xanh lam hoặc xanh lá cây, tùy thuộc vào thuốc nhuộm được sử dụng làm thuốc nhuộm phản màu, chúng được coi là âm tính nhanh với axit (AAR-).

Người giới thiệu

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Khái niệm cơ bản về vi sinh vật học thực hành (xuất bản lần 1). Nhà xuất bản Y học Anh em Jaypee.
2. Bauman, R. (2014). Vi sinh với các bệnh theo hệ thống cơ thể (xuất bản lần thứ 4). Pearson Education, Inc.
3. Di sản, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Vi sinh vật học giới thiệu (xuất bản lần 1). Nhà xuất bản Đại học Cambridge.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Sổ tay hướng dẫn phòng thí nghiệm và sách làm việc trong vi sinh: Ứng dụng để chăm sóc bệnh nhân (ấn bản thứ 11). Giáo dục McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Giáo trình Vi sinh vật học (xuất bản lần 1). BI Ấn phẩm PVT.